Технологические исследования и расчеты
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 0.00 (0 Голоса)

Контроль ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ

Помимо солода, в качестве источника ферментов в спиртовом производстве используют культуры плесневых грибов рода Aspergillus, выращиваемые глубинным и поверхностным способом.

Поверхностным способом культивируют Asp. oryzae и Asp. awamori, глубинным — Asp. usamie, Asp. batatae, Asp. niger.

В выращенных культурах определяют амилолитическую и протеолитическую активность, а также влажность, содержание сухих веществ и углеводов (последний анализ позволяет учитывать расход углеводов на производство культур, который составляет около 85% от углеводов питательной среды).

Контроль культур плесневых грибов производят по схеме 5.

Отбор проб

Поверхностную культуру плесневых грибов на некоторых спиртовых заводах выращивают в специальных цехах, но в большинстве случаев ее получают в готовом виде со специализированных заводов.

При производстве поверхностной культуры непосредственно на заводе пробу отбирают из готовой культуры, подаваемой на производство. Для составления исходной пробы берут выемки из нескольких кювет. При размере партии в 10 кг отбирают пробы из 5 кювет по 40 г. При более крупных партиях —100 г от каждых 40 кг культуры из 5—7 кювет.

При поступлении на завод готовой культуры выемки отбирают стерильным щупом из разных мест партии — 5 мест по 40 г из партии в 10 кг и 5—7 мест по 40 г от каждых 40 кг культуры при больших партиях.

Отобранные выемки помещают в банки с притертой пробкой, перемешивают, отбирают среднюю пробу и выделяют навески по той же методике, как при анализе зерна.

Пробы глубинной культуры отбирают так же, как от жидких полупродуктов — бражки, сусла.

Контроль сырья

Отруби

В каждой партии отрубей, поступающей для выращивания поверхностной культуры, определяют влажность и содержание сбраживаемых углеводов в средней пробе, которую отбирают тем же способом, что и зерно.

Определение влажности отрубей проводят общепринятыми методами.

Определение содержания сбраживаемых углеводов.

Отруби содержат сбраживаемые углеводы в пределах 15—30%, а также большое количество гемицеллюлоз и пентозанов, вследствие чего крахмалистость их нельзя определять поляриметрическими методами. Для определения крахмалистости отрубей пользуются химическим или колориметрическим методами.

Для определения колориметрическим методом взвешивают 4 г отрубей в стаканчик и количественно переносят их в мерную колбу на 200 мл, добавляют 100 мл 0,4%-ного раствора серной кислоты, тщательно перемешивают и помещают в бурно кипящую водяную баню, где выдерживают в течение 15 мин для гидролиза крахмала. По истечении этого времени колбу вынимают из бани, содержимое ее охлаждают до 20° С, объем жидкости доводят дистиллированной водой до метки, добавляют 1 мл воды (объем, занимаемый осадком) и проводят фильтрование. Первые порции фильтрата отбрасывают, а последующие используют для дальнейшего анализа. Отбирают 2—4 мл фильтрата (в зависимости от предполагаемого содержания крахмала в отрубях) в мерную колбу на 100 мл, добавляют для осветления 1 мл 30%-ного раствора сернокислого цинка и после перемешивания 1 мл 15%-ного раствора желтой кровяной соли. Раствор вторично перемешивают, доводят дистиллированной водой до метки и фильтруют. В фильтрате определяют углеводы колориметрическим антроновым методом.

Пример. На анализ взята навеска отрубей 4 г. После гидролиза раствор разбавлен до 200 мл, на вторичное разбавление отобрано 2,0 мл и объем доведен дистиллированной водой до 100 мл. После реакции с антроном получены растворы, оптическая плотность которых равна

Dt = 0,850 (при λ = 610 нм); D2 = 0,420 (при λ = 413 нм);

Скр.=

Где: 18,9 — постоянный коэффициент, полученный экспериментальным путем;

D1 — оптическая плотность, полученная с оранжевым светофильтром;

D2 — оптическая плотность, полученная с синим светофильтром;

N – коэффициент разведения.

Скр.==18,28%

Барда

Для выращивания глубинной культуры плесневых грибов используют грубый фильтрат барды, усредненный до рН 5,2—5,5 магнезитом. В каждой порции барды, поступающей в цех, определяют концентрацию сухих веществ, кислотность и содержание сбраживаемых углеводов.

Определение сухих веществ в барде проводят ареометрическим методом.

Определение сбраживаемых углеводов в барде проводят колориметрическим антроновым методом.

Мука

Муку (ржаную или пшеничную) добавляют в барду в количестве 1—2%, что способствует получению высокой ферментативной активности культуры.

В муке определяют крахмалистость и влажность теми же методами, что и при анализе зерна.

Контроль готовой культуры плесневых грибов

Отбирают среднюю пробу поверхностной культуры и в ней определяют влажность, содержание сбраживаемых углеводов и активность ферментов — амилолитических и протеолитических.

Определение сбраживаемых углеводов в поверхностной культуре плесневых грибов

В культуре содержится около 15% сбраживаемых углеводов от введенных с отрубями. Поверхностная культура, полученная при выращивании различных штаммов плесневых грибов, содержит от 1,80 до 3,50% углеводов от массы культуры.

Для анализа из средней пробы культуры берут навеску 4 г, переводят ее в мерную колбу на 200 мл, добавляют 100 мл 0,4%-кого раствора серной кислоты, проводят гидролиз, как это было описано выше, при анализе отрубей. От разбавленного фильтрата отбирают 10—20 мл в мерную колбу на 100 мл, осветляют, доводят объем раствора до метки и определяют углеводы колориметрическим антроновым методом. Расчет ведут по уравнению

Ссбу.=

Где: 18,9 — постоянный коэффициент, полученный экспериментальным путем;

D1 — оптическая плотность, полученная с оранжевым светофильтром;

D2 — оптическая плотность, полученная с синим светофильтром;

N – коэффициент разведения.

.

Пример. На анализ взята навеска 4 г поверхностной культуры гриба Asp. oryzae влажностью 12%. Из разбавленного раствора отобрано 15 мл и после колориметрической реакции с антроном получены значения оптической плотности D1 = 0,870 и D2=0,490.

Ссбу.==2,394%

В готовой глубинной культуре также определяют сбраживаемые углеводы колориметрическим антроновым методом.

Пример. Фильтрат глубинной культуры разбавлен в 50 раз. После реакции с антроном получены оптические плотности D1 = 0,720, D2=0,370.

Ссбу.=,= 0,331 г/100 мл.

Определение ферментативной, активности

Ферментативную активность плесневых грибов характеризуют амилолитическая, декстринолитическая, глюкоамилазная и протеолитическая активность.

Амилолитическую активность культур плесневых грибов определяют колориметрическим, йодометрическим методом, как и в солоде.

Для анализа поверхностной культуры из средней пробы отбирают две навески; для определения влажности и амилолитической активности.

Для определения АС берут 5 г воздушно-сухой или 10 г сырой культуры, тщательно растирают с кварцевым песком или толченым стеклом в фарфоровой ступке и количественно переводят в стакан или коническую колбу, добавив 10 мл ацетатного буферного раствора с рН 4,7 и 90 мл дистиллированной воды. Смесь выдерживают в течение часа в термостате при 30° С, периодически перемешивая. Затем раствор отфильтровывают, и фильтрат используют в качестве основного раствора для приготовления рабочего раствора фермента, как описано при определении ферментативной активности солода. Ориентировочный расход основного раствора на приготовление рабочего раствора фермента нужной концентрации определяют по табл. 4.

Таблица 4 Приготовление рабочих растворов

(основной раствор содержит воздушно-сухой культуры 5 г/100 мл)

Предполагаемая активность культуры, ед./г

Масса культуры

В рабочем растворе

П, Мг/5 мл

Расход основного раствора на приготовление рабочего раствора, мл

Общий объем разбавленного раствора, мл

5—15

16—50

51—100

101—200

37,5

10

2,5

1,25

15

4

1

1

100

100

100

200

При анализе глубинной культуры отделяют мицелий фильтрацией, и фильтрат используют для приготовления рабочего раствора фермента.

Для этого берут от 1 до 5 мл фильтрата (в зависимости от предполагаемой активности культуры) и разводят дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл. С рабочим раствором проводят ферментативную реакцию гидролиза крахмала в указанных выше условиях и проводят определение, как это описано для солода.

Активность определяют по числу единиц, содержащихся в 1 г поверхностной или в 100 мл глубинной культуры. Расчет ведут по уравнениям:

Для поверхностной культуры

АС=

Для глубинной культуры

АС=

Где N2— число миллилитров глубинной культуры, взятое на анализ.

Пример. Для анализа взято 10 г поверхностной культуры Asp. oryzae. Предполагаемая активность (штамм гриба высокоэффективен по амилазе) лежит в пределах 160—200 ед./г. По табл. 15 находим количество раствора, которое необходимо взять. Для вторичного разбавления— 1 мл/200 мл. В таком случае n=2,5 мг.

При колориметрировании получаем значения оптической плотности

D1=0,750 и D2=0,423.

Количество прогидролизованного крахмала

C==0,04361 г

Амилолитическая активность культуры составит

АС==111,6 ед/г.

Осахаривающую активность (метод ВНИИПрБ) культур грибов определяют с применением колориметрического антронового метода по прописи, приведенной для анализа солодов. Определение можно вести в той же реакционной среде, которую приготовили для определения АС.

Осахаривающую активность ОС культур грибов по полученной оптической плотности определяют по уравнению

ОС=

Где DОптическая плотность раствора;

П — масса культуры, взятой на ферментативную реакцию, мг.

Пример. На анализ взята поверхностная культура гриба Asp. oryzae n=2,5 мг. После реакции получен раствор с оптической плотностью D=0,450.

Осахаривающай активность составит

ОС== 25,85 ед./г.

Определение протеолитической активности (метод ВНИИФСа)

Протеолитическая активность характеризует способность ферментов катализировать расщепление белков до пептидов и аминокислот. Культуры плесневых грибов характеризуются числом единиц протеолитической активности (ПАк), содержащихся в 1 г исследуемого материала.

За единицу протеолитической активности принимается такое количество ферментов, которое катализирует расщепление 1 г белка в строго стандартных условиях (температура 30° С; рН среды 7,0; продолжительность протеолиза 30 мин; постоянное соотношение фермент — субстрат в среде, обеспечивающее гидролиз белка на 50% до продуктов, не осаждающихся трихлоруксусной кислотой за 30 мин).

В основу определения протеолитической активности положена зависимость степени протеолиза белка от числа единиц фермента, взятого на анализ для проведения ферментативной реакции.

Количество превращенного белка определяют с применением интерферометрического метода. Активность ферментных материалов определяют по специально выведенному графику (или уравнению), на котором по оси ординат отложена разность показателей преломления, а по оси абсцисс — число единиц фермента.

Относя полученную величину к 1 г исследуемого ферментного материала, определяют его активность в условных единицах.

Для определения протеолитической активности поверхностной культуры готовят вытяжку из нее (5 г воздушно-сухой или 10 г сырой культуры на 100 мл), при определении в глубинной культуре ее разбавляют описанным выше способом.

Для приготовления рабочего раствора берут различное количество основного раствора в зависимости от предполагаемой активности культуры и разбавляют дистиллированной водой до 50 или 100 мл.

B качестве субстрата используют 1%-ный раствор казеина.

Ход определения. В пробирку высотой 180 мм и диаметром 20 мм берут 10 мл субстрата и помещают ее в ультратермостат с температурой 30±0,2°С на 5—10 мин, чтобы раствор принял необходимую температуру. Затем, не вынимая пробирки из термостата, наливают в нее 5 мл рабочего ферментного раствора (испытуемая проба), смесь перемешивают и выдерживают в термостате в течение 30 мин для протеолиза белка под действием исследуемых ферментов. По истечении этого времени в пробирку наливают 10 мл 4%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для инактивации фермента и осаждения высокомолекулярных продуктов протеолиза, жидкость перемешивают и смесь выдерживают в том же ультратермостате (t = 30° С) в течение 15 мин.

Одновременно ставят контрольный опыт, для чего в пробирку наливают 10 мл 4%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и приливают 5 мл ферментного раствора, который инактивируется под действием кислоты. Содержимое пробирки перемешивают, выдерживают 5 мин, приливают к смеси 10 мл субстрата и ставят в ультратермостат с температурой 30° С на 15 мин для осаждения белка. Затем пробирки вынимают из термостата, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют содержимое через бумажный складчатый фильтр. В прозрачном фильтре определяют интерференцию на интерферометре марки ИТР-2 и снимают показания Т На барабане прибора. Показания барабана определяются разностью показателей преломления (А∆) двух сравниваемых жидкостей, поэтому для простоты расчета при анализе можно пользоваться этим показанием.

При работе с прибором используют кювету с длиной грани 2 см, наливая в правую ее камеру контрольный, а в левую— испытуемый растворы. Для обеспечения точности анализа необходимо, чтобы в процессе ферментативной реакции в продукты, не осаждаемые трихлоруксусной кислотой, перешло 20—75% белка. Для этого на анализ необходимо брать такое количество культуры, чтобы показания барабана интерферометра Т Не превышали 500. Значение Т Пропорционально разности показателей преломления, которая в данном случае определяется количеством образовавшихся при гидролизе белка продуктов, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой (аминокислот и. пептидов). Количество этих продуктов определяет скорость ферментативной реакции гидролиза белка, а, следовательно, и активность исследуемого материала в принятых единицах.

Активность протеолитических ферментов (ПС) определяют по специально разработанному уравнению, подставляя в него полученные при анализе показания барабана интерферометра Т

ПС=

Где 0,1702 и 10,213 — коэффициенты, найденные экспериментально.

Пример. На анализ взята поверхностная культура гриба Asp. oryzae.

Приготовлен основной раствор с содержанием 5 г культуры в 100 мл. На приготовление рабочего раствора взято 7,5 мл основного, и объем его доведен до 50 мл дистиллированной водой. В 5 мл такого рабочего раствора содержится 0,0375 г культуры (n = 37,5 мг).

При анализе получено показание интерферометра m = 320. Протеолитическая активность культуры составит

ПС== 1,18 ед./г.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить

По темам:

История Украины

Культурология

Высшая математика

Информатика

Охотоведение

Статистика

География

Военная наука

Английский язык

Генетика

Разное

Технологиеские темы

Украинский язык

Филология

Философия

Химия

Экология

Социология

Физическое воспитание

Растениевосдство

Педагогика

История

Психология

Религиоведение

Плодоводство

Экономические темы

Бухгалтерские темы

Маркетинг

Иностранные языки

Ветеринарная медицина

Технические темы

Землеустройство

Медицинские темы

Творчество

Лесное и парковое хозяйство