Статьи по растениеводческим темам
  • Регистрация
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 0.00 (0 Голоса)

УДК 635.25/26 : 631.147

Удосконалення технології клонального

мікророзмноження часнику в культурі in vitro

Івченко Т. В. – к. с.- г. наук, старший науковий співробітник, Віценя Т. І. м. н. с., (Інститут овочівництва і баштанництва УААН)

Вступ. Серед овочевих рослин, які вирощуються в Україні, часник займає важливе місце завдяки високим біологічним, смаковим і їстівним якостям. За стандартною технологією розмноження цієї культури здійснюється зубками та повітряними цибулинами, у поєднанні з методом клонового добору. Не стрілкуючий підвид, до якого відносять ярі сорти, розмножується виключно зубками. Такий спосіб розмноження має певні обмеження: низький коефіцієнт розмноження, накопичення на матеріалі фітопатогенів – грибів, бактерій та вірусів. Використання ураженого вихідного матеріалу в селекції і насінництві призводить до того, що навіть нові сорти знаходяться під загрозою виродження. Віруси, потрапив у рослини, суттєво змінюють типовий для даного сорту обмін речовин і стають причиною зниження урожайності (на 30 –50 %) та погіршення якості матеріалу. Суттєво покращити ситуацію в країні можливо, залучивши до її вирішення сучасні біотехнологічні методи, а саме метод клонального мікророзмноження.

Розмноження часнику у культурі in vitro відбувається за рахунок активізації росту адвентивних пагонів, що дозволяє провести оздоровлення та масове клональне розмноження матеріалу. Найбільш визнаний і широко використовуваний спосіб оздоровлення посадкового матеріалу часнику від вірусної інфекції – культура апікальних меристем in vitro. Теоретична основа цього способу – давно визначений факт, що вміст вірусів в рослині зменшується в напрямку до точки росту. Вважається, що окремі зони апікальної меристеми і навіть вся апікальна меристема є вільною від вірусів внаслідок того, що розповсюдження останніх по рослині відстає від швидкого росту апікального купола [1]. Рослини часнику, оздоровлені методом культури меристем, не мають хромосомних порушень, мають добрий фізіологічний стан і високу продуктивність [2].

Для мікроклонування in vitro часнику в якості експланту у стрілкуючих форм використовують денця зубків та повітряних цибулинок і тканини молодих суцвіть, у не стрілкуючих форм - денця зубків [3].

Ефективне застосування методів in vitro неможливе без детального відпрацювання всіх технологічних етапів клонального мікророзмноження. Саме тому, основною метою наших досліджень стала розробка способів клонального мікророзмноження часнику в культурі in vitrо та вивчення впливу трофічних і гормональних факторів та умов культивування in vitro на ефективність клонального мікророзмноження.

Методика досліджень. Всі роботи з клонального мікророзмноження проводились в лабораторних умовах, за розробленою методикою [4]. Для одержання експлантатів використовували сорти селекції інституту - Мереф’янський білий та Дюшес. Відбирали здорові рослини, які мали всі апробаційні ознаки сортів. Для оздоровлення садивного матеріалу часнику від вірусів проводили термічну обробку зубків при температурі 36 ˚С протягом 40 днів. Відібрані експланти очищували від бруду, відмерлих тканин та стерилізували цілком. Експлантати спочатку занурювали у розчин етилового спирту з масовою часткою 70% на 30 секунд, потім у розчин гіпохлориту натрію з масовою часткою 2,6% на 15-20 хвилин. Після цього експлантати промивали не менше 5 разів стерильною дистильованою водою. Після стерилізації з зубків та повітряних цибулинок виділяли меристеми розміром 0,5 – 1 мм і висаджували на поживні середовища згідно табл. 1.

Для прискореного клонування in vitro перспективного матеріалу у простерилізованих зубків та повітряних цибулинок зрізували соковиті луски, щоб луски над денцем не перевищували 0,5 см. Тканини, які безпосередньо контактували зі стерилізуючим розчином обрізали скальпелем, а денце розрізали на шматочки не більше ніж 0,5 см2. При використанні в якості первинного експлантату меристемних тканин молодих суцвіть, верхню частину суцвіття зрізали, а базальну частину висаджували на середовище (табл.2). Для культивування експлантів використовували живильні середовища з вмістом мінеральних речовин за прописами МС [5] з додаванням фітогормонів. Висаджений на середовища матеріал культивували за температурою від 22°С до 26°С і 16-годинному фотоперіоді. Інтенсивність освітлення змінювали відповідно типу донорського ексипанту: при культивуванні меристем у перший місяць підтримували освітлення 2-3 клк, протягом наступних місяців – 5 клк; шматочки денець культивували при 5 клк. Наступні пасажі проводили через кожні 4-6 тижнів, переносячи рослини-регенеранти на поживні середовища МС без додавання регуляторів росту. Кількість пасажів залежала від потрібної кількості матеріалу. Одержані рослини регенеранти з добре розвиненими листками висаджували під час останнього пасажу у пробірки на середовищем МС, що містило 1мг/л ІОцК. Рослини, які сформували від 3 до 7 листків та п’ять і більше нормально розвинених корінців адаптували та висаджували в оптимальні строки (в квітні) у відкритий ґрунт, де вирощували за загальноприйнятою для культури технологією.

Збирання проводили через 110-120 днів вирощування.

Результати досліджень. Для успішного розмноження часнику в культурі тканин важливо правильно підібрати склад живильного середовища і вид експланту, що забезпечує масову регенерацію рослин in vitro. Апікальні меристеми, виділені з зубків та повітряних цибулинок було висаджено на тверде живильне середовище МС з різним вмістом фітогормонів (табл.1). Відновлення росту меристем на індукційних середовищах починалось через 7-10 днів. Розвиток відбувався по типу прямого органогенезу. Найкращі результати по культивуванню апікальних меристем зубків отримано на середовищі МС з додаванням 0,5 мг/л БАП і 0,1 мг/л ІОцК. Висока концентрація цитокініну в варіантах 4, 5, 7 і 8 пригнічувала ріст листків, деякі з них мали деформований вигляд. На середовищі МС без гормонів відмічено слабкий ріст листя або взагалі відсутність росту.

Таблиця 1

Вплив складу живильного середовища МС на активацію росту апікальних меристем часнику (після 60 днів культивування)

вар.

Вміст регуляторів росту у середовищі (мг/л)

% життєздатних меристем

Довжина пагону,

мм

Кількість листків, шт.

Кількість

сформов.

початков.

коренів, шт.

Апікальні меристеми виділені з зубків

1

Без гормонів (контроль)

59,3±12,3

11,4±1,5

2,2±0,2

0,5±0,1

2

0,5мг/л кінетину +0,1мг/л ІОцК

100,0

59,3±3,6

2,9±0,1

1,5±0,3

3

0,5мг/л БАП + 0,1мг/л ІОцК

100,0

75,1±2,9

3,1±0,2

2,1±0,4

4

4мг/л БАП+2мг/л НОцК

100,0

38,3±2,1

3,0±0,2

1,1±0,2

5

2мг/л БАП+1мг/л НОцК

100,0

47,3±2,6

2,9±0,3

1,5±0,1

6

1мг/л БАП + 0,5мг/л НОцК

100,0

54,8±2,1

2,6±0,2

1,4±0,3

7

4мг/л БАП+

2мг/л ІОцК

100,0

41,4±1,6

2,0±0,1

1,0±0,2

8

2мг/л БАП+1мг/л ІОцК

100,0

48,9±1,3

2,2±0,2

1,7±0,2

9

1мг/л БАП + 0,5мг/л ІОцК

100,0

57,23±1,74

3,0±0,2

1,6±0,2

НІР 4,3 0,4 0,4

Апікальні меристеми виділенні з повітряних цибулинок

1

Без гормонів (контроль)

100,0

42,8±1,5

2,2±0,1

2,0±0,1

2

0,5мг/л кінетину +0,1мг/л ІОцК

100,0

62,5±3,5

2,9±0,2

2,2±0,1

3

1 мг/л кінетину +0,5мг/л ІОцК

100,0

55,0±2,9

3,1±0,2

4,1±0,3

4

1 мг/л БАП +

0,5 мг/л ІОцК

100,0

70,5±2,1

3,0±0,2

4,3±0,3

5

2 мг/л БАП + 1мг/л ІОцК

100,0

48,1±2,6

2,9±0,3

4,8±0,5

6

0,5 мг/л ІОцК

100,0

52,5±2,1

2,6±0,2

4,0±0,3

7

1 мг/л ІОцК

100,0

50,5±1,6

2,0±0,2

4,9±0,4

8

2 мг/л ІОцК

100,0

48,2±2,3

3,1±0,2

4,2±0,1

9

0,5мг/л БАП + 2 мг/л ІОцК

100,0

52,2±1,4

2,1±0,1

3,4±0,2

10

0,1мг/л БАП +

1 мг/л ІОцК

100,0

76,3±1,7

3,0±0,2

6,1±0,4

НІР 15,7

0,41

1,5

При доборі оптимальних умов культивування апікальних меристем,

отриманих з повітряних цибулинок, визначено, що найкращі результати забезпечує середовище МС з додаванням 0,1 мг/л БАП і 1 мг/л ІОцК. На середовищах, де концентрація ІОцК становила 2 мг/л спостерігалося потовщення листя і уповільнення їх росту. За результатами дисперсійного аналізу можна зробити висновок, що на довжину пагону суттєво впливає варіант середовища (Fфакт.>Fтеор. для даної ознаки), на кількість листків варіант середовища впливає не суттєво (Fфакт. <Fтеор. для даної ознаки).

Порівняльний аналіз результатів досліду з культивування апікальних меристем часнику показує, що меристеми з повітряних цибулинок є більш зручним експлантатом, тому що вони вихід стерільних рослин в них вищий, а отримані рослини – регенеранти утворюють корінці без додаткового етапу культивування на середовищі з ауксинами.

Використання апікальних меристем дозволяє провести оздоровлення рослини від патогенів, але недоліком цього виду експланту є значні витрати часу на виділення меристем та низький коефіцієнт розмноження: з одного зубка можна отримати одну апікальну меристему. Тому було поставлено за мету розробити технологію прискореного розмноження оздоровлених зразків часнику методами клонального мікророзмноження в культурі in vitro.

В досліді були застосовані середовища з різним вмістом регуляторів росту. На першому етапі регенерації при використанні всіх типів експлантів (денець зубків та повітряних цибулинок), суцвіть, утворювались чисельні дрібні пагони, які через 30 днів розділялись і пересаджувались для додаткового підрощення і укорінення на середовище МС без гормонів.

При використанні в якості первинного експланту тканин денця зубків було випробувано 9 варіантів живильних середовищ (табл. 2). Кращим середовищем для одержання пагонів з меристемних тканин зубка виявилось середовище МС з додаванням 3мг/л БАП і 0,5 мг/л ІОцК. Позитивну регенераційну реакцію у досліді було одержано у всіх варіантах з використанням в живильних середовищах високих концентрацій БАП (2-3 мг/л).

Таблиця 2

Вплив стимуляторів росту в середовищі МС на активацію росту пагонів з меристемних тканин часнику (2007-2008 р.)

вар.

Вміст регуляторів росту у середовищі (мг/л)

Рівень регенерації,

%

Отримано мікропагонів з одного первинного

експлантату, шт.

 

Тканини денця

 

1

3мг/л БАП +1,5 мг/л НОцК

96,7±2,5

17,4 ± 4,9

 

2

2мг/л БАП +1мг/л НОцК

73,3±3,9

16,1 ± 3,9

 

3

1мг/л БАП +0,5мг/л НОцК

0

0

 

4

3мг/л БАП +0,5мг/г ІОцК

100,0

21,1 ± 3,2

 

5

2мг/л БАП +0,5мг/л ІОцК

60,0±5,1

14,3 ± 1,5

 

6

1мг/л БАП +0,5мг/л ІОцК

0

0

 

7

3мг/л БАП

83,3±5,9

18,9 ± 4,3

 

8

2мг/л БАП

46,7±3,7

11,2± 2,7

 

9

1мг/л БАП

0

0

 

Тканини молодих суцвіть

 

1

3мг/л БАП+0,5мг/л ІОцК

100,0

53,7±4,4

2

2мг/л БАП

100,0

41,8±2,9

3

3мг/л БАП+0,5мг/л ІОцК

100,0

45,4±3,9

4

3мг/л БАП+1,5мг/л НОцК

100,0

57,7±4,5

5

3мг/л БАП

100,0

51,0±3,7

6

2мг/л кінетину+0,5мг/л ІОцК+50мг/л аденіну

100,0

60,1±3,2

7

0,1мг/л БАП+0,1мг/л ІОцК+

+50мг/л аденіну

100,0

53,9±3,2

Тканини денця повітряних цибулинок

 

1

МС без гормонів

0

0

 

2

МС+0,5мг/л БАП

+0,1мг/л НОцК

0

0

 

3

МС+1мг/л БАП

+0,5мг/л НОцК

0

0

 

4

МС+2мг/л БАП

+1мг/г ІОцК

73,3±6,0

6,4 ± 1,3

 

5

МС+3мг/л БАП

+1,5мг/л ІОцК

93,3±2,1

7,6 ± 2,8

 

6

МС+4мг/л БАП

+2мг/л ІОцК

100,0

11,1 ± 2,3

 

НІР 05 33,8

 

Додаткове введення у склад середовищ ауксинів (НОцК) позитивно

вплинуло на підвищення коефіцієнту регенерації у досліді. При вирощуванні донорського матеріалу на середовищах з низькою концентрацією БАП 1 мг/л регенерація була відсутня (вар. 3, вар. 6, вар. 9).

При використанні в якості первинного експланту меристемних тканин молодих суцвіть експлантати висаджували на живильні середовища, що містили різну концентрацію регуляторів росту і аденін. Статистична обробка показала (табл. 2), що кращим живильним середовищем для отримання пагонів з меристемних тканин суцвіть є варіант 6 (МС + 2мг/л кінетину+0,5 мг/л ІОцК+50 мг/л аденіну). Кращим середовищем для одержання пагонів з денець повітряних цибулинок виявилось середовище МС з додаванням 4мг/л БАП і 2 мг/л ІОцК. Позитивний регенераційний відгук у досліду було одержано у всіх варіантах з використанням в живильних середовищах високих концентрацій БАП (2-4 мг/л). При вирощуванні донорського матеріалу на середовищах з концентрацією БАП 1 мг/л і нижче регенерація була відсутня на всіх варіантах (вар. 1, вар. 2, вар. 3).

Порівнюючи ефективність використання різних типів експлантатів для прискореного розмноження часнику можна зробити висновок, що найкращим первинним матеріалом є молоді суцвіття. Мікроклонування суцвіть проводиться за мінімальної кількості гормонів у середовищі, при цьому забезпечується найбільший коефіцієнт розмноження – 40-60 регенерантів з одного суцвіття. Разом з тим суцвіття можна використовувати нетривалий період, лише з 15 по 30 червня, на відміну від зубків часнику, які можна використовувати з листопада по березень (6-8 місяців).

При використанні в якості первинного експланта тканин денця зубків, регенерацію отримували додаючи в живильне середовище підвищені концентрації фітогормонів, коефіцієнт розмноження при цьому становить від 10 до 20 мікропагонів з зубка. Повітряні цибулинки є одним з кращих джерел первинного матеріалу, так як можливість їх застосування становить близько 10 місяців. Вони сформовані в надземній частині рослини і значно менш забруднені, ніж органи (зубки), які сформовані в ґрунті. Застосовуючи в якості експланту меристематичні тканини денця повітряних цибулинок, можливо отримати від 5 до 10 регенерантів.

Висновки. Застосування у овочівництві методики оздоровлення і прискореного розмноження вітчизняних сортів часнику стане основою ведення селекційної і насінницької роботи у відповідності до загально прийнятих світових стандартів, забезпечить прискорене розмноження і оздоровлення рослин від інфекцій; дозволить зменшити площі та заощадити трудові і матеріальні витрати для їх вирощування, сприятиме підвищенню урожайності оздоровленого матеріалу

Список використаної літератури

1. Тюкавин Г. Б. Получение безвирусного чеснока. Ж. Плодоовощное хозяйство, № 4, 1987, с. 63.

2. Bhojwani S. S. In vitro propagation of garlic by proliferation. - Scientia Horticulturae. 13 (1980) 47 – 52.

3. Марьяхина И. Я., Черемушкина Н. П., Полумордвинова И. В. Получение и размножение безвирусных растений чеснока и лука – шалота в культуре ткани. // Доклады ВАСХНИЛ, 1984, № 4. С. 9-11.

4. Методика досліджень в культурі ізольованих тканин овочевих рослин. - Мерефа, 2004. – 26 с.

5. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid grown and bioassay with tobacco tissue culture // Physiologia Plantarum. - 1962. -15. P. 473-497.

6. Keller E. R.J., Senula A. In vitro techniques to improve the germplasm preservation – case studies for three temperate crops and some general remarks

// In vitro culture, transformation and molecular markers for crop improvement. Eds. Islam I. 2004, p.107-117.

Анотації

УДК 635.25/26 : 631.147

Івченко Т. В. Усовершенствование технологии клонального микроразмножения чеснока в культуре in vitro.

Разработана биотехнология клонального микроразмножения чеснока на основе культуры изолированных меристем in vitro. Представлена последовательность этапов размножения, оптимальный донорный материал для клонирования, состав питательных сред для размножения и укоренения растений - регенерантов.

УДК 635.25/26 : 631.147

Івченко Т. В. Удосконалення технології клонального мікророзмноження часнику в культурі in vitro.

Розроблена біотехнологія клонального мікророзмноження часнику на основі культури ізольованих меристем in vitro. Викладено послідовності етапів розмноження, оптимальні донорські експланти для клонування, склад живильних середовищ для розмноження і укорінення рослин-регенерантів.

УДК 635.25/26 : 631.147

Ivchenko Т.V. Improvement of technology micropropagation of garlic in culture in vitro.

The biotechnology cloning micro propagation of garlic on the basis of culture isolated meristems in vitro is developed. There is given succession of propagation stages, optimal donor explants for cloning, composition of nutrient medium for propagation and rooting of plants – regenerants.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить

По темам:

История Украины

Культурология

Высшая математика

Информатика

Охотоведение

Статистика

География

Военная наука

Английский язык

Генетика

Разное

Технологиеские темы

Украинский язык

Филология

Философия

Химия

Экология

Социология

Физическое воспитание

Растениевосдство

Педагогика

История

Психология

Религиоведение

Плодоводство

Экономические темы

Бухгалтерские темы

Маркетинг

Иностранные языки

Ветеринарная медицина

Технические темы

Землеустройство

Медицинские темы

Творчество

Лесное и парковое хозяйство