Статьи по растениеводческим темам
  • Регистрация
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 0.00 (0 Голоса)

ОТРИМАННЯ БЕЗВІРУСНИХ РОСЛИН СУНИЦІ В КУЛЬТУРІ МЕРИСТЕМ

Медведєва Т. В.- канд. біол. наук, старший науковий співробітник

Тряпіцина Н. В.- канд. с.-г. наук, старший науковий співробітник

Сидоренко О. В.- агроном

Удовиченко В. М. – зав. відділом вірусології, оздоровлення та розмноження плодових і ягідних культур

(Інститут садівництва УААН)

Вступ. Суниця садова (Fragaria х ananassa Duch.) дуже чутлива до враження вірусами – на цей час відомо понад 30 вірусів і фітоплазм, дія яких призводить до втрат близько 80% її продукції [1]. Вірусна інфекція суниці призводить до зниження врожайності, погіршення якості ягід, зменшення кількості новоутворених розеток та кореневої маси материнської рослини. Ця симптоматика значним чином підсилюється при комплексному інфікуванні декількома вірусами. При вегетативному способі розмноження суниці патогени передаються від інфікованої рослини до наступних генерацій, що спричиняє негативний вплив на господарсько цінні ознаки сорту і знижує продуктивність промислових насаджень. Тому при закладанні промислових площ поряд з вибором сорту та технології першочерговим питанням є використання високоякісного безвірусного садивного матеріалу. Культура верхівкових меристем є унікальним методом для оздоровлення рослин від вірусів, віроїдів, мікоплазм, бактерій і грибів завдяки високій метаболічній активності меристемної зони, відсутності в ній васкулярної системи та високому вмісту ауксинів, які за думкою деяких авторів пригнічують розмноження вірусів [2]. Необхідність включення мікроклонального розмноження в систему вирощування розсади суниці викликана ще й тим, що для деяких сортів (переважно ремонтантних) через біологічні особливості (цвітіння і плодоношення на розетках, низька здатність до утворення вусів) розмноження традиційним способом ускладнено. Оздоровлення промислових насаджень плодових і ягідних культур від комплексу захворювань підвищує їх продуктивність у 6-8 разів, тому поза сумнівом необхідними є подальше удосконалення і розвиток цього напрямку. Для суниці культура тканин з метою оздоровлення від вірусів вперше була застосована в 60-х роках минулого століття і з тих пір використовується в сертифікаційних схемах виробництва здорового садивного матеріалу у всьому світі [3]. Однак не існує універсальної рецептури стосовно мінерального складу та концентрацій і співвідношення ауксинів і цитокінінів у середовищі для культивування, яка б забезпечувала стабільно високий рівень проліферації всіх сортів. Більш того, навіть при культивуванні на одному й тому ж за складом середовищі рослини з різним генотипом поводять себе не однаково. Тому метою наших досліджень була оптимізація системи прискореного розмноження безвірусної суниці ряду сортів вітчизняної селекції та інтродукованих зарубіжних як одноразового, так і безперервного плодоношення для створення промислових маточників.

Методика досліджень. Робота виконувалась у відділі вірусології, оздоровлення та розмноження плодових і ягідних культур Інституту садівництва УААН протягом 2004-2008 рр. Об’єктом були сорти суниці з колекційних насаджень, зокрема сорти раннього строку дозрівання – Хоней, Веселка, Ольвія, Розана київська; пізнього строку – Презент, Флоренс, Молінг Пандора; ремонтантний сорт Женева та сорти нейтрального дня – Сельва, Брайтон, Королева Єлизавета. Для ініціювання культури in vitro меристематичні апекси виділяли в липні-серпні з рослин, перевірених на вірусоносійство класичним сендвич-методом імуно-ферментного аналізу [4]. Були використані сертифіковані специфічні антитіла виробництва Loewe Phytodiagnostica, Німеччина, до 4-х неповірусів, а саме: вірусів латентної кільцевої плямистості суниці, чорної кільчастості томатів, мозаїки резухи та кільцевої плямистості малини. Апекси стерилізували 70% етанолом та 0,1% розчином сулеми (HgCl2). Базальне середовище для проліферації суниці містило солі і вітаміни по Мурасіге і Скугу (MS) [5], 30 г/л сахарози і 7 г/л агару, pH 5,6-5,8. Концентрація екзогенного цитокініну (6-бензиламінопурину, БАП) варіювала на різних етапах дослідження: 0,2 мг/л в середовищі для ініціювання культури, 0,4, 0,6, 0,8 і 1,0 мг/л в середовищі для проліферації. Гіберелову кислоту та індолилмасляну кислоту (ІМК) додавали в концентрації 0,1 мг/л. Рослини культивували при температурі 22°С, освітленні 2,5-3 тис. люкс, фотоперіоді 16/8 годин. Чергові пересадки проводили через 45 днів з підрахунком коефіцієнта розмноження для кожного сорту.

Результати дослідження. Технології одержання вільного від вірусної інфекції садивного матеріалу передбачають застосування вірусологічного контролю на всіх етапах розмноження рослин. Сьогодні імуноферментний аналіз є найбільш ефективним скринінговим тестом для виявлення вірусних інфекцій в рослинному матеріалі завдяки високому рівню достовірності та стандартизованості і швидкому отриманню результатів. Такі переваги методу, а також мінімальна кількість рослинного матеріалу, необхідного для проведення аналізу, зробили ІФА зручним для відбору безвірусних маточних і одержаних після терапії рослин при виробництві оздоровленого садивного матеріалу [6]. Методом ІФА нами були виділені безвірусні маточні кущі суниці, що відповідали помологічним ознакам сорту, та в яких при візуальному обстеженні не виявлено симптомів хвороб і карантинних об'єктів. Результати серологічного аналізу (рис.1) вказують на високий загальний рівень вірусної інфекції в тестованих рослинах суниці, що є доказом необхідності досліджень по її оздоровленню. З перевірених зразків лише незначний відсоток рослин (10-37 в залежності від сорту) був вільним від вірусів, за якими проводилось тестування. Найбільш інфікованими виявились зразки суниці ремонтантного сорту Женева (90,1%). Серед вірусів, якими інфіковані досліджувані сорти, переважають віруси кільцевої плямистості малини (25-84%) та латентної кільцевої плямистості суниці (41-75%). Експланти з рослин, вільних від комплексу вірусів, за якими проводили тестування, відбирали для введення в культуру in vitro і подальшого культивування на середовищі Мурасіге-Скуга. На етапі проліферації важливим є пошук ефективних препаратів для стимулювання пагоноутворення - цитокінінів. При мікроклонуванні суниці найбільш вживаним є БАП.

 

Рис.1.Результати серологічного аналізу рослин-донорів експлантів

Примітка: ArMV – вірус мозаїки резухи (Arabis mosaic virus); RRSV – вірус кільцевої плямистості малини (Raspberry ringspot virus); SLRV – вірус кільцевої латентної плямистості суниці (Strawberry latent ringspot virus); TBRV – вірус чорної кільчастості томатів (Tomato blackring virus)

Ми вивчали дію різних концентрацій цього цитокініну на процес утворення додаткових пагонів у експлантів досліджуваних сортів. Концентрація варіювала на різних етапах дослідження: від 0,2 мг/л в середовищі для ініціювання культури до 0,4 мг/л; 0,6 мг/л; 0,8 мг/л і 1,0 мг/л в середовищі для проліферації. В табл.1 приведені результати залежності коефіцієнта розмноження від концентрації БАП, які виявляють відмінності в рівнях проліферації як між сортами, так і в межах одного сорту при різних концентраціях БАП у середовищі для розмноження. У всіх досліджуваних сортів спостерігали позитивну реакцію на підвищення концентрації БАП– коефіцієнт розмноження зростає і досягає максимуму на 4-5 пасажі. Водночас було помічено, що за високого вмісту цитокініну в живильному середовищі (1,0 мг/л і вище) цей показник знижується, змінюється морфологія рослин (спостерігається посилене розростання листової пластинки, викривлення пагонів, гіпергідратація), зменшується їх здатність до вкорінення.

Таблиця 1

Вплив концентрації БАП в живильному середовищі на коефіцієнт пагоноутворення суниці

Сорт суниці

Концентрація 6-БАП, мг/л

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Веселка

1,3 ± 0,08

3,4 ± 0,06

5.0 ± 0,14

5,0 ± 0,09

4,5 ± 0,05

Ольвія

1,1 ± 0,09

2,3 ± 0,03

3,6 ± 0,036

3,8 ± 0,04

3,2 ± 0,05

Розана київська

1,2 ± 0,06

2,6 ± 0,058

3,7 ± 0,061

3,9 ± 0,064

3,3 ± 0.12

Хоней

1,2 ± 0,17

2,5 ± 0,09

3,3 ± 0,14

3,1 ± 0,15

2,8 ± 0,08

Презент

1,3 ± 0,06

3,3 ± 0,09

4,2 ± 0,10

4,5 ± 0,12

4,0 ± 0,05

Флоренс

1,1 ± 0,18

2,4 ± 0,08

2,8 ± 0,07

2,6 ± 0,09

2,3 ± 0,11

Молінг Пандора

1,2 ± 0,081

2,4 ± 0,086

2,7 ± 0,08

2,8 ± 0,088

2,4 ± 0,084

Женева

1,3 ± 0,07

2,5 ± 0,085

5,0 ± 0,133

4,7 ± 0,14

4,4 ± 0,04

Сельва

1,4 ± 0,07

2,7 ± 0,08

6,3 ± 0,10

6,1 ± 0,09

4,8 ± 0,2

Брайтон

1,2 ± 0,099

2,6 ± 0,09

3,7 ± 0,074

3,5 ± 0,084

3.1 ± 0,081

Королева Єлизавета

1,1 ± 0,073

2,3 ± 0,092

3,8 ± 0,089

3,6 ± 0,082

3,0 ± 0,135

Примітка: в таблиці подано середні дані з 6-ти пасажів

При тривалому культивуванні цих сортів (6 і більше пасажів) навіть на середовищі з помірною концентрацією бензиламінопурину (0,6-0,8 мг/л) спостерігалось зниження коефіцієнта розмноження. Очевидно, що накопичення екзогенного цитокініну перевищило необхідний для розмноження фізіологічний рівень і замість стимулюючої дії спостерігається пригнічення ростових процесів. Оптимальною для досліджуваних сортів суниці є концентрація БАП у межах 0,6–0,8 мг/л. При такому рівні цитокініну в живильному середовищі найвищий коефіцієнт розмноження демонстрували сорти Веселка (5,0-5,5), Сельва (6,3-6,5), Презент (4,5-4,9), Женева (5,0-5,1). На маточних насадженнях у відкритому ґрунті ці сорти (за винятком сорту Женева) теж демонстрували високий приріст вусів. Таким чином, рівень проліферації досліджуваних сортів в культурі in vitro обумовлений передусім спадковими характеристиками сорту.

Сучасні теоретичні дослідження в області мікроклонального розмноження намагаються вирішити дві основні проблеми – досягнення оптимального коефіцієнту розмноження і зведення до мінімуму можливості відхилення від характеристик сорту. Для суниці згадані проблеми вирішуються обмеженням кількості субкультур та культивуванням на середовищах з невисокою концентрацією цитокінінів. При апробації маточних насаджень суниці нами не зафіксовано фактів відхилення від сортових характеристик.

Таблиця 2

Укорінення суниці в умовах in vitro

Сорт суниці

Укорінених рослин, %

Початок ризогенезу

Кількість коренів на рослину, шт

Середня довжина коренів, см

Веселка

94

8 – 10 день

6,5

3,2

Ольвія

92

8 – 10 день

5,4

2,7

Розана київська

91

10 -14 день

4,8

2,1

Хоней

91

10 -14 день

4,5

1,9

Презент

95

8 – 10 день

5,7

3,1

Флоренс

93

10-12 день

5,5

2,9

Молінг Пандора

93

10 -14 день

4,7

2,6

Женева

94

8 – 10 день

6,7

3,4

Сельва

95

8 – 10 день

6,4

3,3

Брайтон

92

10-12 день

4,4

2,3

Королева Єлизавета

93

10-12 день

5,2

2,8

Для укорінення мікропагонів суниці ми не додавали індукторів ризогенезу в живильне середовище. Відсоток укорінених рослин на такому безгормональному середовищі складав 91-95 (табл.2), корені були укорочені та потовщені, а висота мікропагонів коливалась в межах 5-7 см (рис.2). В залежності від сорту початок ризогенезу спостерігали на 8-й – 14-й день. Через 20 – 25 днів укорінені рослини були готові до акліматизації та адаптації. При акліматизації важливе значення має підтримання високого рівня вологості в перші дні та температури в межах 16-18 °С - це забезпечувало мінімум втрат рослинного матеріалу. Після загартування на вегетаційному майданчику рослини висаджували в маточник або передавали в фермерські господарства для створення маточних насаджень.

Рис.2. Суниця сорту Брайтон, укорінена в умовах in vitro

Ретестування експлантів на різних стадіях культивування підтвердило відсутність в них вірусних інфекцій. Культивування in vitro забезпечує також оздоровлення від комплексу грибної та бактеріальної інфекції. Тому такі рослини придатні для створення вихідних маточних насаджень, які мають на 50% вищу продуктивність по розсаді в порівнянні з рослинами, що розмножуються за традиційними технологіями [7].

Таким чином, використання біотехнологічних методів у садівництві має велике практичне значення для виробництва оздоровленого садивного матеріалу, що, в свою чергу, сприяє підвищенню продуктивності маточних і плодоносних насаджень. Технологічні ланки виробництва оздоровленого садивного матеріалу суниці можна представити у вигляді схеми, приведеної на рис.3.

Рис.3.Схема виробництва оздоровленого садивного матеріалу суниці

Висновки. В результаті досліджень було встановлено:

-  оптимальним для проліферації досліджуваних сортів суниці є живильне середовище MS, що містить 0,6-0,8 мг/л БАП;

-  найвищий коефіцієнт розмноження демонстрували сорти Веселка (5,0-5,5), Сельва (6,3-6,5), Презент (4,5-4,9), Женева (5,0-5,1);

-  для індукції ризогенезу суниці можна використовувати безгормональне середовище.

Список використаної літератури

1. Spiegel S. Virus certification of strawberries / S. Spiegel // Plant virus disease control. – 1998.- Р. 320-324.

2. Ahmed I., Hossain M., Bari M. A., Alam M. F. Plant regeneration of two tomato (Licopersicon esculentum Mill.) Varieties through meristem culture / I. Ahmed, M. Hossain, M. A.Bari, M. F.Alam // Bangladesh Journal Genet Biotechnology.– 2000.– №109.–Р.113

3.Boxus P. H. Rapid production of virus free strawberry plants by in vitro culture / P. H.Boxus // Acta Horticulturae.– 1976.– №66.–Р.35-38

4. Clark M. F.Characteristics of the microplate method of the enzyme – linked immunosorbent аssay for the detection of plant virus / M. F.Clark, A. N.Adams// J. Gen. Virol. – 1977. - 34, №3. – P.475-483.

5. MurashigeT., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures/ T. Murashige, F. Skoog // Physiologia Plantarum.−1962. – №15. – Р.473-497.

6. Гнутова Р. В. Серология и иммунохимия вирусов растений / Р. В.Гнутова – М.:Наука, 1993.– 300с. (РАН. Дальневост. отд-ние. Биол.-почвен. ин-т)

7. Damiano C. Strawberry micropropagation / C. Damiano – Maryland, USA, 1980.–Р.93-101 (In: Proceedings of the conference on nursery production of fruit plants through tissue culture: Application and feasibility. Beltsville)

УДК 581.143.6:634.75

Медведєва Т. В., Тряпіцина Н. В., Сидоренко О. В.,Ю., Удовиченко В. М.

Получение безвирусных растений земляники в культуре меристем

Представлена схема производства безвирусных растений земляники садовой (Fragaria x ananassa Duch.) для создания промышленных насаждений.

УДК 581.143.6:634.75

Медведєва Т. В., Тряпіцина Н. В., Сидоренко О. В.,Ю., Удовиченко В. М.

Отримання безвірусних рослин суниці в культурі меристем

Представлена схема виробництва безвірусних рослин суниці садової (Fragaria x ananassa Duch.) для створення промислових насаджень.

УДК 581.143.6:634.75

Production of strawberry virus free plant material through meristem culture

The authors present the scheme of production for virus free plant material of strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) for creating of industrial planting.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить

По темам:

История Украины

Культурология

Высшая математика

Информатика

Охотоведение

Статистика

География

Военная наука

Английский язык

Генетика

Разное

Технологиеские темы

Украинский язык

Филология

Философия

Химия

Экология

Социология

Физическое воспитание

Растениевосдство

Педагогика

История

Психология

Религиоведение

Плодоводство

Экономические темы

Бухгалтерские темы

Маркетинг

Иностранные языки

Ветеринарная медицина

Технические темы

Землеустройство

Медицинские темы

Творчество

Лесное и парковое хозяйство