Статьи по растениеводческим темам
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 0.00 (0 Голоса)

УДК 633. 111: 57. 085. 2

МОРФОГЕНЕЗ ЕКСПЛАНТІВ ПШЕНИЦІ М’ЯКОЇ В КУЛЬТУРІ ПИЛЯКІВ ПІД ВПЛИВОМ МЕТАБОЛІТІВ ГРИБІВ РОДУ FUSARIUM

Корня Т. М. – аспірант (Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН)

Ігнатова С. А. – д. б. н., завідуюча лабораторією культури тканин ПБЦ УААН

Вступ. У створенні сортів пшениці головними вимогами щодо якості нових форм є продуктивність колосся та стійкість рослин до абіотичних та біотичних факторів. Серед проблем вирощування велику загрозу представляють грибні патогени, особливо - Fusarium graminearum Schwabe. Даний патоген є збудником фузаріозу колосу – захворювання пшениці, при якому втрати врожаю можуть сягати в роки епіфітотій більше 50 %. Різні штами даного гриба виділяють мікотоксини, що накопичуються в зерні та можуть спричинити важкі отруєння у тварин та людини через вживання продуктів харчування від уражених фузаріумом рослин. Токсини Fgraminearum є термостабільними речовинами, тому навіть термічна обробка їжі не виключає можливість отруєння [2, 9]. Тому селекція стійких до фузаріозу колосу форм пшениці, на відміну від використання фунгіцидів, є актуальною.

Традиційні методи селекції у створенні сортів стійких до патогенів займають більше 10 років, тому для скорочення строків окремих етапів селекції актуальною є розробка та вдосконалення методів біотехнології, насамперед методу культури пиляків пшениці. Культивування ізольованих пиляків на живильних середовищах in vitro базується на феномені андрогенезу [8], що заключається у формуванні рослини-регенеранту з гаплоїдної мікроспори. На сьогодні існує необхідність в подальшому вивченні умов культивування пиляків пшениці в умовах in vitro в присутності селективного фактору, а саме необхідним є підбір його сублетальної концентрації для ефективного добору in vitro толерантних до фузаріозу колоса форм пшениці.

Фільтрат культуральної рідини (ФКР) Fgraminearum як можливий селективний чинник найближче відображає одночасну дію усіх метаболітів гриба на фізіологічний стан рослини, та зокрема на морфогенез окремих експлантів в культурі in vitro. Відомо, що гриби роду Fusarium окрім токсинів та гыдролітичних ферментів, які власне уражують рослини, можуть виділяти ще й речовини-фітогормони, зокрема гібберелову кислоту [6], що може бути використано біотехнологами у дослідах з метою підвищення рівня регенерації фертильних рослин подвоєних гаплоїдів. Тому використання ФКР в умовах in vitro є цікавим у створенні системи добору толерантних до фузарієвих патогенів нових форм пшениці. Використання розчинів чистих мікотоксинів [7] у вивченні їх дії на морфогенез експлантів пшениці має наукову цінність для подальшого застосування отриманих результатів в селекції in vitro стійких до фузаріозу форм пшениці.

Методика досліджень. В дослідах використовували матеріал двох гібридних комбінацій: 292/2 та 490/6, отриманих від схрещування сорту Фантазія з лініями, що мають в родоводі сорт Одеська напівкарликова та дику форму Aegilops.

В якості селективного фактору використовували мікотоксини фузарієвих грибів: DON, Zearalenone та Fusaric acid, а також ФКР, що готували культивуванням гриба Fgraminearum сильно - 56 та слабкопатогенного штаму ab впродовж 21 доби при 22 °С на стандартному рідкому живильному середовищі Чапека у модифікації – з 30 г глюкози. Далі рідину відділяли від міцелію гриба та стерилізували через фільтри Milipore 0,22 мкм.

За експлант використовували пиляки, що перебували в стадії сильновакуолізованої мікроспори, яку визначали візуально по розміщенню колосу в трубці та підтверджували цитологічним аналізом. Зрізані пагони з колоссям попередньо витримували на холоді при 2-4°С в темряві впродовж 4-7 діб.

Колосся стерилізували насиченим розчином «Білизна» за загальноприйнятою методикою [5]. Пиляки виділяли в умовах ламінар-боксу на первинне живильне середовище 190-2 (контрольне та селективне), з додаванням 1,5 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л кінетину, 90 г/л сахарози, 400 мг/л проліну і глютаміну. Перші три доби пиляки культивували в темряві при температурі 30 °С, далі при 24 °С до появи перших новоутворень, які потім пересаджували на контрольне та селективне живильні середовища MS з 30 г/л сахарози, 200 мг/л проліну та глютаміну, 0,5 мг/л кінетину та 2,4-Д [10], та витримували при температурі 24 °С до появи на новоутвореннях центрів меристематизації. Далі сформовані регенеранти висаджували на безгормональне середовище MS [9] та культивували при 24 °С та 16-год фотоперіоді. Сформовані регенеранти яровізували при низьких позитивних температурах впродовж 50 днів, після чого рослини висаджували у вазони з ґрунтом та дорощували до колосіння в умовах фітотрону.

Для створення селективних живильних середовищ ФКР Fgraminearum додавали у концентрації 15% та 30% від об’єму живильного середовища в первинне індукційне середовище 190-2 для культивування пиляків – це перший етап селекції in vitro, та в середовище MS для культивування новоутворень з пиляків на етапі індукції регенерації – другий етап. Контрольними живильними середовищами слугували стандартні середовища без ФКР. Для вивчення системи добору толерантних до ФКР форм пшениці на другому етапі, на селективні живильні середовища висаджували новоутворення, що були сформовані з пиляків на контрольному первинному середовищі без ФКР. Враховували два типи новоутворень: морфогенні (ембріоїди, калюси білі, компактні із зонами меристематизації та ембріонально-клітинні комплекси ЕКК) і неморфогенний калюс (прозорий, желеподібний). Підраховували відсоток сформованих регенерантів з обох типів новоутворень.

З метою вивчення впливу мікотоксинів на формування новоутворень, розчини вносили в первинне живильне середовище для культивування пиляків у наступних концентраціях: DON і Zearalenone – по 250 та 750 мкг/л [7]; Fusaric acid – 50, 100 та 500 мкг/л [4].

Кількість новоутворень рахували у відсотках від загальної кількості пиляків. Частоту регенерації визначали у кількості сформованих регенерантів від загальної кількості висаджених пиляків на варіант – ефективність культури пиляків, та від кількості новоутворень – ефективність морфогенезу. Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою комп’ютерної програми EXCEL. Вірогідність розходжень між вибірковими частками визначали за критерієм Фішера F (формула 1) [1]:

(1)

де n1 та n2 - обсяги вибірок; φ1 φ2 – кути в радіанах для часток порівнюваних вибірок :

Аналіз варіації досліджуваної ознаки у вибірках з великим обсягом n→∞ та малою часткою ознаки << 25% проводили за допомогою методу довірчих інтервалів для біноміального розподілу дат. Висновок про вплив фактору на ознаку робили, порівнюючи інтервали у вибірках між собою. Частоти появи новоутворень та регенерації (відносно кількості пиляків) відповідають біноміальному розподілу дат у вибірках, де досліджувана ознака перебуває у двох станах, наприклад: регенерація, або її відсутність (формула 2):

(2)

де - частота досліджуваної ознаки (=m/n); р1 та р2 – нижня та верхня межі довірчого інтервалу (формула 3) [3]:

(3)

t – нормоване відхилення (t =1,96 при α=0,95), ω – частота досліджуваної ознаки у вибірці (ω = ).

У таблицях дані параметрів індукції новоутворень та регенерації представлені у відсотках. Поруч відсоткового значення досліджуваної ознаки вказані верхня та нижня межі довірчого інтервалу.

Результати дослідження. З метою вивчення впливу ФКР Fgraminearum на морфогенез експлантів в культурі пиляків м’якої пшениці, було проведено попереднє тестування на андрогенез in vitro гібридних форм пшениці додаванням ФКР Fgraminearum в первинне живильне середовище 190-2 для культивування пиляків та в середовище MS для новоутворень. Таким чином був визначений оптимальний гібридний матеріал для подальших досліджень.

Тестування показало, що дві гібридні комбінації: 292/2 та 490/6, на нашу думку, відповідають вимогам досліду. Вони характеризуються достатнім рівнем формування новоутворень з пиляків та регенерації зелених рослин подвоєних гаплоїдів як на контрольних варіантах, так і на варіантах живильних середовищ в присутності ФКР Fgraminearum.. На одному з дослідних варіантів відмічено позитивний вплив селективного фактору (ФКР) на формування новоутворень і відповідно на регенерацію рослин у гібриду 490/6 (таб. 1). Форма 292/2 відрізняється значно вищим рівнем регенерації на контрольному живильному середовищі ніж форма 490/6, але на фоні ФКР відсоток новоутворень зменшувався (Р<0,05). Ефективність морфогенезу (відсоток регенерації рослин з новоутворень) під дією ФКР обох штамів Fgraminearum збільшувалась, тому доцільним стало поглиблене вивчення морфогенезу в культурі пиляків м’якої пшениці на селективному фоні. Оскільки з додаванням ФКР слабкопатогенного штаму ab показники формування новоутворень та регенерації форми 490/6 достовірно збільшувались (Р<0,05), а у форми 292/2 достовірно зменшувались (Р<0,05) в порівнянні з контролем, то такі ФКР є цікавими з точки зору використання в селекції in vitro – з одного боку, та в культурі пиляків, зокрема для підвищення

Таблиця 1

Назва гібридної форми

Концентрація ФКР F. graminearum, %

Кількість пиляків, шт.

Кількість новоутворень

Частота регенерації рослин

Зелених

Загальна

від новоутворень

від висаджених пиляків

від новоутворень

від висаджених пиляків

%

Довір. ін-л

шт./n

%

%

Довір. ін-л

шт./n

%

%

Довір. ін-л

292/2

контроль

445

7,64

10,49

5,52

6/34

17,65

1,35

2,91

0,62

8/34

23,53

1,80

3,50

0,91

штам ab

15%

760

2,24*

3,55

1,40

3/17

17,65

0,39

1,15

0,13

5/17

29,41

0,66

1,53

0,28

30%

730

0,82*

1,78

0,38

1/6

16,67

0,14

0,77

0,02

1/6

16,67

0,14*

0,77

0,02

штам 56

15%

880

2,61*

3,89

1,75

8/23

34,78

0,90

1,78

0,46

9/23

39,13

1,02

1,93

0,54

30%

300

3,00

5,60

1,59

5/9

55,56**

1,67

3,84

0,79

5/9

55,56**

1,67

3,84

0,02

490/6

контроль

935

2,35

3,54

1,56

1/22

4,55

0,11

0,60

0,02

1/22

4,55

0,11

0,60

0,02

штам ab

15%

500

14,00*

17,32

11,23

9/70

12,86

1,80*

3,39

0,95

12/70

17,14

2,40*

4,15

1,38

30%

500

1,60

3,13

0,81

0/8

-

-

0,76

0,02

0/8

-

-

0,77

0,02

штам 56

15%

680

2,79

4,32

1,80

2/19

10,53

0,29

1,07

0,08

2/19

10,53

0,29

1,06

0,08

30%

580

2,24

3,80

1,31

4/13

30,77**

0,69

1,76

0,27

4/13

30,77**

0,69

1,76

0,27

Індукція новоутворень в культурі пиляків під впливом ФКР Fgraminearum на живильному середовищі 190-2 та подальша регенерація рослин подвоєних гаплоїдів у гібридів м’якої пшениці

Примітка: * - статистично значуща різниця у порівнянні з контролем при Р<0,05 за методом довірчих інтервалів

** - статистично значуща різниця у порівнянні з контролем при Р<0,05 за критерієм Фішера

регенерації – з іншого. Отже, наступною задачею роботи стало вивчення дії ФКР слабкопатогенного штаму Fgraminearum на індукцію регенерації рослин з новоутворень при додаванні культуральної рідини в живильне середовище MS для культивування новоутворень (таб. 2).

Таблиця 2

Регенерація рослин м’якої пшениці з новоутворень під дією ФКР Fgraminearum штаму ab на живильному середовищі MS

Назва гібридної форми

Концентрація селективного фактору, %/л

Всього

висаджено новоутворень, шт.

Частота регенерації рослин

З морфогенних новоутворень

З неморфогенних новоутворень

шт.

%

шт

%

292/2

контроль

20

9/12

75,00

0/8

0,00

ФКР

F. grami-nearum ab

15%

13

5/8

62,50

0/5

0,00

30%

9

3/7

42,86

0/2

0,00

490/6

контроль

24

1/12

8,33

3/12

25,00

ФКР

F. grami-nearum ab

15%

20

5/10

50,00*

0/10

0,00

30%

36

2/12

16,67

1/24

8,33

Примітка: * - статистично значуща різниця у порівнянні з контролем при Р<0,05 за критерієм Фішера

За отриманими результатами можна заключити, що у генотипу 490/6, що відрізняється регенерацією рослин переважно з неморфогенного калюсу (точніше з калюсу некомпактної структури), на селективних середовищах з ФКР Fgraminearum показник регенерації змінився в сторону підвищення регенерації з морфогенних новоутворень (компактний калюс) та інгібування регенерації з неморфогенних калюсів. Даний висновок підтверджують дані регенерації рослин у генотипу 292/2, котрий характеризується регенерацією лише з морфогенного калюсу, ембріоїдів та прямої регенерації. У цієї гібридної форми показник регенерації на селективних середовищах з ФКР залишився на рівні з контролем. Статистичної різниці знайдено не було (таб. 2), хоча за даними таблиці 1 на етапі селекції in vitro на рівні індукції новоутворень ФКР інгібує появу новоутворень у генотипу 292/2 в порівнянні з контролем.

З метою вивчення впливу мікотоксинів на частоту новоутворень досліджуваних гібридів, в первинне індукційне живильне середовище 190-2 токсини DON, Zearalenone та Fusaric acid вносили у різних концентраціях (таб. 3). За отриманими результатами у гібридів 292/2 та 490/6 під впливом токсинів на окремих варіантах спостерігали достовірний позитивний вплив (Р<0,05) селективного фактору в порівнянні з контролем на формування новоутворень, зокрема у генотипу 292/2 на варіанті з токсином DON (250 мкг/л) та у генотипу 490/6 – на варіантах середовищ з Fusaric acid (50 мкг/л). У цьому разі для даних генотипів необхідним є вивчення впливу токсинів DON (для 292/2) та Fusaric acid (для 490/6) на етапі індукції регенерації із сформованих новоутворень. Для генотипу 292/2 через достатній показник частоти морфогенних новоутворень оптимальним є добір in vitro з використанням токсину Zearalenone в первинному живильному середовищі на етапі їх формування. Актуальним також є вивчення впливу суміші фузарієвих токсинів на різні етапи морфогенезу.

Висновки. В залежності від генотипу можливо формувати системи селекції in vitro толерантних до фузарієвих метаболітів гомозиготних форм м’якої пшениці на різних етапах морфогенезу. Для визначення типу системи добору, чи то на первинному індукційному середовищі, чи на етапі індукції регенерації, необхідно проводити попередній скринінг гібридних форм щодо їх чутливості до селективного фактору та рівня регенерації на контрольних середовищах без грибних метаболітів.

Таким чином, генотипи, що мають низький рівень частоти новоутворень на живильних середовищах без ФКР та токсинів і в яких за рахунок грибних метаболітів підвищується кількість новоутворень та рівень регенерації оптимальним є добір in vitro на етапі формування новоутворень. У разі високого рівня новоутворень на контрольних живильних середовищах, добір толерантних форм рослин доцільно проводити на етапі індукції регенерації.

Таблиця 3

Назва генотипу

Концентрація токсину, мкг/л

Кількість пиляків, шт.

Кількість новоутворень, %

Частота регенерації від висаджених пиляків

зелених рослин

альбіносів

Морфогенних

Неморфогенних

%

шт.

Дов. ин-л

шт.

%

Дов. ин-л

%

Дов. ин-л

%

Дов. ин-л

490/6

контроль

1456

2,95

3,95

2,20

5,15

6,40

4,13

11

0,76

1,35

0,42

1

0,07

0,39

0,01

DON

250

281

7,12*

10,74

4,65

2,49

5,05

1,21

5

1,78

4,10

0,76

1

0,36

1,99

0,06

750

270

2,59

5,25

1,26

2,96

5,74

1,51

1

0,37

2,07

0,07

0

0,00

1,40

0,00

Zearalenone

250

287

1,74

4,01

0,75

3,14

5,85

1,66

2

0,70

2,50

0,19

0

0,00

1,32

0,00

750

300

4,67

7,68

2,80

2,67

5,17

1,36

2

0,67

2,40

0,18

0

0,00

1,26

0,00

Fusaric acid

50

385

3,90

6,33

2,38

1,82

3,70

0,88

3

0,78

2,27

0,27

0

0,00

0,99

0,00

100

467

1,93

3,62

1,02

1,28

2,77

0,59

6

1,28

2,77

0,59

0

0,00

0,82

0,00

500

449

2,23

4,05

1,21

0,89

2,27

0,35

2

0,45

1,61

0,12

2

0,45

1,61

0,12

292/2

контроль

2032

0,98

1,52

0,64

0,49

0,90

0,27

15

0,74

1,21

0,45

2

0,10

0,36

0,03

DON

250

367

1,09

2,77

0,42

0,54

1,96

0,15

0

0,00

1,04

0,00

0

0,00

1,04

0,00

750

228

0,44

2,44

0,08

0,88

3,14

0,24

1

0,44

2,44

0,08

0

0,00

1,66

0,00

Zearalenone

250

456

0,66

1,92

0,22

0,44

1,58

0,12

1

0,22

1,23

0,04

0

0,00

0,84

0,00

750

408

0,25

1,38

0,04

0,25

1,38

0,04

1

0,25

1,38

0,04

0

0,00

0,93

0,00

Fusaric acid

50

355

3,38*

5,81

1,94

3,94

6,51

2,36

8

2,25

4,38

1,15

2

0,56

2,03

0,15

100

599

0,50

1,46

0,17

0,17

0,94

0,03

1

0,17

0,94

0,03

1

0,17

0,94

0,03

500

421

1,90

3,70

0,97

0,24

1,33

0,04

1

0,24

1,33

0,04

2

0,48

1,72

0,13

Індукція новоутворень в культурі пиляків в присутності фузарієвих токсинів на живильному середовищі 190-2 та регенерація рослин подвоєних гаплоїдів у гібридів м’якої пшениці

Примітка: * - статистично значуща різниця у порівнянні з контролем при Р<0,05 за методом довірчих інтервалів

Список використаної літератури

1.  Атраментова Л. О., Утєвська О. М. Статистичні методи в біології: Підручник. – Х.: ХНУ імені В. Н. Каразіна, – 2007. – 288 с.

2.  Билай В. И. Фузарии. – Киев: Наукова думка, 1977. – 441 с.

3.  Гланц С. Медико-биологическая статистика / Пер. с англ. Ю. А. Данилова – М.: Практика, – 1998. – 459 с.

4.  Лаврова Н. В. Разработка и применение биотехнологий для получения устойчивых к фузариозу растений озимой пшеницы (гаплоидная) и огурца (меристемная, каллусная и микроспорогенная): Автореферат дисс. … докт. биол. наук. – М., – 2006. – 46 с.

5.  Лобанова К. І., Жосонар М. В., Ігнатова С. О. Шляхи реалізації регенераційного потенціалу в культурі пиляків у різних генотипів озимох м’якої пшениці // Вісник Укр. т-ва генетиків і селекціонерів. – 2006. – Т. 4, №1. – С. 52-57.

6.  Регуляторы роста растений / [Гамбург К. З., Кулаева О. Н., Муромцев Г. С., и др.] ; под ред. академика ВАСХНИЛ Г. С. Муромцева. – М. : «Колос», 1979. – 245 с.

7.  Eudes F., Collin J., Roux S., Comeau A. Sélection in vitro pour la résistance à la fusariose de l’épi chez le blé. // 6èmee J. Scientifiques du Biotechnologies Végétales AUPELF. UREF – Orsay, 1997. – P. 335-336.

8.  Sunderland N. Anther and pollen culture // Proceed. IV John Innes Sympos. "The plant genome". Norwich, 1980, Р. 171-183.

9.  Wangn X., Hu H. The effect of potato II medium for triticale anther culture // Plant Sci. Lett. – 1984. – V. 36. – P. 237-239.

10.  Wolf-Hall C. E., Hanna M. A., Bullerman L. B. Stability of deoxynivalenol in heat-treated foods // J. Food Prot. – 1999. – V.62. – N 8. – P.962–964.

УДК 633. 111: 57. 085. 2

Корня Т. М., Игнатова С. А. Морфогенез эксплантов мягкой пшеницы в культуре пыльников под влиянием метаболитов грибов рода Fusarium.

Показано влияние селективных факторов в виде ФКЖ и токсинов фузариевых грибов на количество сформированных новообразований из пыльников и индукцию регенерации. Предложены две системы отбора in vitro толерантных к селективному фактору форм пшеницы для генотипов, отличающихся отзывчивостью в культуре пыльников, уровнем регенерации и реакцией на присутствие селективного фактора.

УДК 633. 111: 57. 085. 2

Корня Т. М., Ігнатова С. А. Морфогенез експлантів м’якої пшениці в культурі пиляків під впливом метаболітів грибів роду Fusarium.

Показаний вплив селективного фактору у вигляді ФКР та токсинів фузарієвих грибів на кількість сформованих новоутворень з пиляків та індукцію регенерації. Запропоновані дві системи добору in vitro толерантних до селективного фактору форм пшениці для генотипів, що відрізняються чутливістю в культурі пиляків, рівнем регенерації та реакцією на присутність селективного фактору.

УДК 633. 111: 57. 085. 2

Kornya t. M., Ignatova S.A. Morphogenesis of the explants of common wheat in the anther culture under the influencing of Fusarium fungus metabolites.

Influencing of selective factors was shown as CLF and toxins of fusarium fungus on the amount of new formations that were formed from anthers and on the induction of regeneration. Two systems of the in vitro selection were offered tolerant to the selective factor of wheat for genotypes, different by sensitive in the anthers culture, level of the regeneration and reaction on the presence of the selective factor.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить

По темам:

История Украины

Культурология

Высшая математика

Информатика

Охотоведение

Статистика

География

Военная наука

Английский язык

Генетика

Разное

Технологиеские темы

Украинский язык

Филология

Философия

Химия

Экология

Социология

Физическое воспитание

Растениевосдство

Педагогика

История

Психология

Религиоведение

Плодоводство

Экономические темы

Бухгалтерские темы

Маркетинг

Иностранные языки

Ветеринарная медицина

Технические темы

Землеустройство

Медицинские темы

Творчество

Лесное и парковое хозяйство