Статьи по растениеводческим темам
  • Регистрация
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 0.00 (0 Голоса)

УДК 633.81: 58.085

КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ ГЕРАНИ ЭФИРОМАСЛИЧНОЙ В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ IN VITRO

Егорова Н. А. – кандидат биол. наук, старший научнй сотрудник

(Институт эфиромасличных и лекарственных растений УААН)

Введение. Клональное микроразмножение in vitro на сегодняшний день является одним из наиболее эффективных способов размножения растений, который не только позволяет во много раз повысить коэффициент размножения и ускорить традиционный селекционный процесс за счет быстрого размножения ценных генотипов и сортов, но и может быть эффективным экспериментальным подходом, используемым для других задач растениеводства, в частности, получения оздоровленного посадочного материала или создания коллекций генетической плазмы [1, 5, 6]. Технологии микроразмножения в культуре изолированных тканей и органов широко используются в настоящее время в практике селекции и семеноводства у многих видов растений, в том числе и у эфиромасличных. Известно несколько методов микроразмножения, при этом выбор метода в значительной степени обусловлен морфогенетическими особенностями культивируемых тканей и органов растения и конкретными задачами селекции и семеноводства. Чаще всего применяется метод активации развития уже существующих на растении меристем, который позволяет с максимальной вероятностью получать материал, генетически идентичный исходному, а также является основой технологий оздоровления растений от вирусов и других патогенов [1, 5]. Для ряда видов растений высокую эффективность показали и другие методы размножения in vitro, в частности индукции прямого морфогенеза из тканей эксплантов или индукции почек или эмбриоидов из каллусных культур [6 ]. Однако при прямом и, особенно, непрямом морфогенезе не исключается вероятность возникновения сомаклональной вариабельности, поэтому эти методы могут использоваться только у видов с очень низким уровнем изменчивости в культуре тканей.

Ценным эфиромасличным растением, широко возделываемым в Грузии, Армении, Таджикистане, Франции, Алжире и других странах мира, является эфиромасличная герань. Под общим названием «эфиромасличная герань» в специальной литературе обычно объединяют несколько видов, относящихся к роду Pelargonium семейства Geraniaceae, или гибридов на их основе, которые имеют приятный запах и могут использоваться для получения эфирного масла [4, 9]. Гераниевое эфирное масло используется в парфюмерно-косметической и пищевой промышленности и часто служит для замены дорогостоящего розового масла. Антисептическое, бактерицидное, гемостатическое, тонизирующее, противораковое и другие свойства масла герани способствуют его активному применению в медицине и ароматерапии [4, 9].

Использование биотехнологических подходов микроразмножения in vitro может существенно повысить эффективность традиционной селекции и семеноводства этого вида растения и решить ряд проблем, в частности ускоренного размножения ценного селекционного материала и новых сортов и получения качественного оздоровленного посадочного материала.

В литературе имеются данные об исследовании процессов каллусо - и морфогенеза, а также о возможности применения разных методов in vitro для клонального микроразмножения у различных видов Pelargonium [10-16 ]. Чаще всего для коммерческого размножения используется культура изолированных меристем, особенно для сортов декоративной герани [11 ]. Разработаны методики прямой регенерации растений из стеблевых эксплантов для P. roseum [15 ], P. graveolens [ 14 ] и листовых дисков для P. capitatum, P. graveolens, Phortorum [ 12 ]. В ряде работ для клонального микроразмножения использовали первичные или пассируемые каллусные ткани [8, 10, 16 ]. При этом в отдельных исследованиях отмечалось появление измененных форм растений. Так, Саксена с соавторами при анализе регенерантов, полученных из каллусных культур P. graveolens, выявили 2 морфотипа с отклонениями по ряду характеристик [ 10 ]. При прямой регенерации из листовых дисков все растения ароматической герани были сходны с материнскими растениями, а у P. hortorum было выявлено 71% тетраплоидных регенерантов [12]. Ранее в наших исследованиях была показана возможность получения регенерантов из каллусных культур у эфиромасличных сортов герани и их широкая вариабельность по некоторым хозяйственно полезным признакам [ 2, 7 ].

В задачи данной работы входило изучение процессов морфогенеза в культуре изолированных органов и тканей у эфиромасличной герани с целью разработки методов микроразмножения.

Методика исследований. Материалом для исследования служили сорта эфиромасличной герани из коллекции ИЭЛР УААН – Розовая, Душистая, Крунк, Аист, которые были получены при участии видов Pelargonium roseum Willd., P. radula (Cav.) LHerit., P. capitatum (L.) Ait., P. graveolens (Jacq.) LHerit. [ 4 ]. В качестве эксплантов использовали меристемы с 1-2 листовыми примордиями, а также сегменты стебля, черешка и листовой пластинки взрослых растений. Приготовление питательных сред, введение в культуру и пассирование осуществлялось с применением традиционных методик, принятых в работах по культуре тканей [ 3 ]. Культивирование органов и тканей проводили на различных модификациях агаризованной среды Мурасиге и Скуга (МС), дополненной фитогормонами (БАП; кинетин; НУК; ИУК; 2,3,5 трийодобензойная кислота (ТИБК); 2,4Д; 2,4,5Т; гибберелловая кислота (ГК)). Субкультивирование каллусных тканей и меристемных культур осуществляли каждые 30-40 дней. Культивирование изолированных органов и тканей проводили при температуре + 26оС, влажности 70% и освещенности 2-3 тыс. люкс, с 16-часовым фотопериодом.

Через 1-1,5 месяца культивирования на питательной среде определяли частоту индукции каллусогенеза и морфогенеза, а для меристемных культур - количество развивающихся эксплантов, высоту побегов, количество листьев, частоту образования адвентивных побегов, число побегов на эксплант, частоту каллусогенеза, ризогенеза и витрификации. Регенерированные микропобеги переносили на свежую среду для доращивания и укоренения. Полученные в культуре in vitro растения адаптировали in vivo, а затем высаживали в сосуды с землей и выращивали в условиях закрытого грунта, где в течение 2-3 лет проводили их анализ по морфологии и некоторым хозяйственным признакам.

Все эксперименты были повторены 2-3 раза, а полученные данные обработаны статистически с использованием программы Microsoft Office Excel. Средние арифметические и доверительные интервалы представлены в графическом виде.

Результаты исследования. Ранее для ряда сортов эфиромасличной герани нами были разработаны эффективные методики получения и длительного пассирования каллуса, а также индукции с высокой частотой (до 70-90%) органогенеза или соматического эмбриогенеза при переносе каллусных тканей разных пасажей на регенерационную среду [2]. При этом было показано, что способность к регенерации растений у герани сохранялась в течение длительного времени – до 3–4 лет. Анализ полученных в результате непрямого морфогенеза растений-регенерантов показал их высокую изменчивость по морфологии, фертильности, числу хромосом и хозяйственным признакам [2, 7]. В некоторых вариантах опытов количество измененных форм регенерантов достигало 56-80 %. Наличие такого высокого уровня сомаклональной изменчивости при получении растений эфиромасличной герани с использованием каллусных культур делает их удобным объектом для получения сомаклональных вариантов или клеточной селекции, однако неприемлимо при разработке методик клонального размножения.

Исследование культивирования эксплантов некоторых органов (сегментов стебля, черешка и листовой пластинки) показало, что при использовании питательных сред, содержащих 1-2 мг/л одного из ауксинов (НУК; 2,4Д; 2,4,5Т) в сочетании с 0,05 – 0,5 мг/л БАП или кинетина, происходила индукция каллусогенеза. Однако на отдельных средах, содержащих только цитокинин, у сортов Розовая, Аист и Крунк наблюдалась индукция прямого морфогенеза непосредственно из тканей эксплантов и формировались почки и адвентивные побеги (рис.1). На среде, содержащей 0,5 мг/л БАП, у эксплантов стебля и черешка частота индукции прямого морфогенеза достигала 84 –100% ( в зависимости от генотипа и экспланта). Из сегментов листьев образование адвентивных побегов наблюдалось реже – с частотой не превышающей 45- 56%.

Рис.1. Индукция адвентивных побегов

in vitro из экспланта черешка листа у

герани сорта Розовая

При образовании адвентивных побегов иногда на эксплантах одновременно начинала формироваться каллусная ткань, причем уже в первичном каллусе наблюдались начальные этапы индукции морфогенеза. В результате этих процессов на экспланте мог формироваться пучок побегов, часть которых возникала в результате прямого морфогенеза, а часть – из каллусной ткани в результате непрямого морфогенеза. Значительный уровень сомаклональной изменчивости, выявленный нами ранее в каллусных культурах герани [2], свидетельствует о высокой вероятности появления измененных форм при использовании данного методического подхода в культуре изолированных черешков, стеблей и листьев. Поэтому у изученных сортов герани для клонального микроразмножения, по-видимому, нецелесообразно использовать прямой морфогенез, так как он может сопровождаться формированием каллусной ткани, или же необходим постоянный тщательный контроль образующихся растений для отбраковки измененных форм.

Учитывая высокую вероятность появления сомаклональных вариантов в каллусной культуре герани при использовании прямого или непрямого морфогенеза, по-видимому, самым перспективным методом для получения генетически стабильного материала может быть индукция развития уже существующих меристем. Поэтому основной объем экспериментальных иследований по клональному микроразмножению был связан с оптимизацией различных этапов культивирования изолированных меристем in vitro.

Развитие меристем герани обычно начиналось на 7-10 сутки после их введения в культуру. Экспланты увеличивались в размере, постепенно появлялись сформированные листья и развивались побеги высотой до 16,3± 1,7 мм (сорт Розовая) и 19,5±2,0 мм (сорт Душистая). Изредка у основания побега начиналась индукция каллусогенеза, поэтому при подборе питательных сред необходимо было сводить этот процесс к минимуму. Следует отметить, что у герани уже на 1-м этапе микроразмножения наряду с ростом основного побега наблюдалось формирование до 5-8 дополнительных почек и микропобегов (рис. 2, 3). При анализе различных факторов культивирования было установлено, что наиболее важным является гормональный состав питательной среды. Часть данных, полученных при анализе различных модификаций среды Мурасиге и Скуга, представлена на рис.1 и 2. На безгормональной среде МС145 развития меристем не наблюдалось. Добавление в среду одного из цитокининов (МС 214, 217, 218, 232) благоприятно влияло на развитие меристем, причем БАП вызывал формирование значительно большего числа дополнительных микропобегов и лучшее развитие меристем по сравнению с кинетином. Повышение содержания БАП до 2 мг/л увеличило число побегов, однако до 80-90% этих побегов были витрифицированы, поэтому такое повышение концентрации этого фитогормона нецелесообразно. Введение ауксинов ИУК и НУК в питательную среду, содержащую БАП (МС 224, МС 225), приводило к значительному снижению формирования дополнительных побегов и возрастанию частоты каллусогенеза до 57,1%. Установлено, что на первом этапе микроразмножения лучшее развитие меристем, максимальное число побегов (6,2-7,5 штук на эксплант, в зависимости от сорта), а также минимальная частота каллусогенеза (8-10%) обеспечивались на среде МС 223, содержащей 1,0 мг/л БАП и 0,05 мг/л ТИБК (рис.2, 3).

Рис. 2. Влияние состава питательной среды и сорта на частоту адвентивного побегообразования в культуре меристем у герани эфиромасличной. Гормональные добавки в питательную среду МС (мг/л): МС145 – без гормонов; МС232 – БАП (0,5); МС214 – БАП (1,0); МС217– кинетин (0,5); МС218 – кинетин (1,0); МС 224 – БАП (1,0) +ИУК (0,1); МС 225 – БАП (1,0)+НУК (0,1);МС 229 – БАП (1,0) +ГК (1,0); МС 253 – БАП (0,5)+ ТИБК (0,05); МС 223 – БАП (1,0) + ТИБК (0,05).

Рис. 3. Влияние состава питательной среды и сорта на число побегов на эксплант в культуре меристем у герани эфиромасличной. Обозначения см. рис. 2.

Полученные на этапе введения конгломераты побегов в дальнейшем разделяли на одиночные микропобеги с 2-3 листьями и пересаживали на модификации среды МС со сниженным содержанием некоторых компонентов. На 2-м этапе для размножения у герани можно использовать индукцию пазушных и адвентивных побегов. Анализ полученных экспериментальных данных показал, что лучшее развитие микропобегов и их размножение, а также минимальная частота нежелательных процессов каллусогенеза и витрификации побегов (3-11%) обеспечивались на среде МС 250 достаточно простого состава (½ макро - и микросолей, без витаминов, с 0,1 мг/л БАП и 1% сахарозы). На этой среде в среднем за 4 года исследований коэффициент размножения за один цикл у сорта Розовая составил 8,05±0,23, у сорта Душистая 7,30±0,15, а у сорта Крунк 6,92±0,20. Второй этап может включать несколько циклов размножения in vitro на среде МС 250, позволяющих наращивать количество побегов. При этом было установлено, что в течение года у изученных сортов не происходило достоверного снижения коэффициентов размножения.

1. Влияние гормонального состава питательной среды на укоренение микропобегов герани сорта Розовая

Содержание

фитогормонов

в среде, мг/л

Частота

укоренения, %

Число корней на 1 побег, шт

Длина корня,

мм

ИУК -0,5

68,6±5,0

10,5±0,9

18,5±1,0

ИМК - 0,5

61,5±4,7

5,9±0,4

17,2±0,9

НУК - 0,05;

ИУК - 0,05

88,6±5,2

8,1±0,5

29,0±1,4

НУК - 0,1

97,2±6,1

21,3±1,1

34,2±1,7

НУК - 0,5

90,6±5,9

9,6±0,6

20,1±1,1

НУК - 1,0

81,3±4,8

9,1±0,7

17,5±1,0

Показано, что для герани необходим традиционный 3-й этап укоренения, поскольку полученные в результате микроразмножения in vitro побеги, как правило, не имели корней. Поэтому их переносили на среды с ауксинами и через месяц культивирования определяли частоту образования, количество и длину корней (табл.1). Как видно из представленных данных, из трех анализируемых ауксинов наиболее эффективной для индукции ризогенеза оказалась НУК. При оптимальной концентрации этого фитогормона (0,1 мг/л) наблюдалась максимальная частота укоренения (97,2%) и достоверно более высокие значения длины и количества корней. Повышение содержания НУК до 1,0 мг/л привело к ухудшению всех изученных параметров (табл. 1).

Укорененные проростки герани для дальнейшего развития переносили из культуральных сосудов в обычные условия выращивания. Подобран оптимальный режим акклиматизации in vivo, включающий выращивание меристемных растений первые 2-3 недели в смеси торфа и перлита (1:1) при высокой влажности (90-100%) и освещенности 2 тыс. люкс. Полученные меристемные растения герани по морфологии не отличались от исходных сортов. Сравнительный анализ содержания эфирного масла и некоторых его компонентов (цитронеллола, гераниола, ментона) у растений, размноженных традиционным способом, и полученных в культуре меристем, не выявил достоверных различий по этим параметрам. Следует отметить, что массовая доля эфирного масла (% на сырую массу) у меристемных растений (0,124±0,012) была несколько выше, чем у растений, размноженных черенками (0,084±0,009), что может быть связано с эффектом оздоровления в условиях in vitro. На основе проведенных исследований разработана методика микроразмножения в культуре меристем эфиромасличной герани, которая может быть использована для быстрого размножения растений-регенерантов из каллусных культур, ценного селекционного материала и новых сортов, что позволит существенно повысить эффективность традиционного размножения черенкованием, при котором за год получают не более 15-20 саженцев с куста герани.

Выводы. Исследованы особенности морфогенеза в культуре каллусной ткани и изолированных органов у эфиромасличной герани с целью разработки метода клонального микроразмножения in vitro. Показана возможность прямого морфогенеза при культивировании эксплантов стебля, черешка и листа. Установлено, что из-за высокого уровня сомаклональной изменчивости для микроразмножения у герани нежелательно использовать индукцию прямого морфогенеза (иногда сопровождаемую каллусогенезом) и, особенно, непрямого морфогенеза из каллусных культур. Определены оптимальные питательные среды для основных этапов размножения в культуре меристем у различных сортов эфиромасличной герани. Размножение in vitro осуществлялось за счет образования дополнительных побегов, при этом коэффициент размножения, в зависимости от сорта, составлял 7-8 за один цикл.

Список использованной литературы

1.  Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. Учебное пособие / Бутенко Р. Г. – М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. – 160с.

2.  Егорова Н. А. Получение исходного материала для селекции эфиромасличной герани методами культуры ткани / Н. А. Егорова, А. М.Бугара, А. М. Ермилова // Труды ИЭЛР. – 1998. – т 24. –С. 98–110.

3.  Калинин Ф. Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Калинин Ф. Л., Сарнацкая В. В., Полищук В. Е. – К.: Наук. думка, 1980. – 488 с.

4.  Кучулория Т. Л. Итоги селекции герани розовой / Т. Л. Кучулория // Эфирномасличные растения, их культура и переработка. – М., Пищевая промышленность,1968. – с.39–51.

5.  Мельничук М. Д. Біотехнологія рослин: Підручник / Мельничук М. Д., Новак Т. В., Кунах В. А. – К.: Поліграф Консалтинг, 2003. – 520 с.

6.  Митрофанова И. В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур: автореф. дис. на соискание науч. степени докт. биол. наук: спец. 03.00.20 «Биотехнология»/ И. В. Митрофанова. – Ялта, НБС-ННЦ, 2007. – 40с.

7.  Потемкина Н. В. Цитогенетические исследования растений эфиромасличной герани, полученных в культуре тканей/ Н. В. Потемкина, Н. А. Егорова, А. М. Бугара // Цитология и генетика. – 2004. – № 2. – С. 26-30.

8.  Саркисян Э. Д. Культивирование герани сопряженным методом клонального микроразмножения и гидропоники/ Э. Д. Саркисян, С. Х. Майрапетян, Н. Н.Тамбиян и др. // Межд. конф. «Физиол. раст. – наука 3-го тысячелетия», Москва, 4-9 окт.,1999: Тез. докл. Т.2. – М., 1999. – С.688.

9.  Смолянов А. М. Эфиромасличные культуры / А. М. Смолянов, А. Т. Ксендз – М., Колос,1976. – 336с.

10.  An efficient in vitro procedure for micropropagation and generation of somaclones of rose scented Pelargonium / G. Saxena, S. Banerjee, L. Rahman [et al.] // Plant Science. – 2000. – V.155, N2. – P.133–140.

11.  Cassells A. C. Plant and in vitro factors influencing the micropropagation of Pelargonium cultivars by bud-tip culture /A. C. Cassells, G. Minas// Sci. Hort. – 1983. – N21. – P.53–65.

12.  Hassanein A. Efficient plant regeneration system from leaf discs of zonal (Pelargonium x hortorum) and two scented geraniums / A. Hassanein, N. Dorion // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2005. – V.83, N 2.– P.231-240.

13.  Murthy B. N. S. Induction of high-frequency somatic embryogenesis in geranium (Pelargonium х hortorum Bailey cv. Ringo Roso) cotyledonary cultures / B. N. S. Murthy, R. P. Singh, P. K. Saхena // Plant Cell Repts. – 1996. – 15, № 6. – P. 423–426.

14.  Nowak K. Regeneracja Pelargonium graveolens L. w kulturze in vitro /K. Nowak, K. Zajac // «Pr. nauk. USI. Katowicach. Acta biol. Siles.». –1987. – N7. – P.9–14.

15.  Onisei T. Rapid clonal propagation of scented geranium / T. Onisei //An. Sti. Univ./Sec.2. – 1993. – N39. – P.125–127.

16.  Reuther G. Untersuchungen zur Vermehrung von Pelargonienvarietaten durch Gewebekultur / G. Reuther // Gartenbauwissenschaft. – 1975. –N4. – P.181-187.

УДК 633.81: 58.085

Егорова Н. А. Клональное микроразмножение эфиромасличной герани в культуре изолированных органов и тканей in vitro

Исследованы особенности морфогенеза в культуре каллусной ткани и изолированных органов у эфиромасличной герани с целью разработки метода клонального микроразмножения in vitro. Показана возможность индукции прямого морфогенеза при культивировании эксплантов стебля, черешка и листа. Определены оптимальные условия для различных этапов размножения в культуре меристем эфиромасличных сортов герани.

УДК 633.81: 58.085

Єгорова Н. О. Клональне мікророзмноження ефіроолійної герані в культурі ізольованих органів та тканин in vitro

Досліджені особливості морфогенезу в культурі калусної тканини і ізольованих органів у ефіроолійної герані з метою розробки методу клонального мікророзмноження in vitro. Показана можливість індукції прямого морфогенезу при культивуванні експлантів стебла, черешка і листа. Визначені оптимальні умови для різних етапів розмноження в культурі меристем ефіроолійних сортів герані.

УДК 633.81: 58.085

Yegorova N. A. Clonal micropropagation of essential oil geranium in isolated tissue and organ culture in vitro

The peculiarities of morphogenesis in callus tissue culture and isolated organs of essential oil geranium was investigated for the purpose of development the clonal micropropagation method in vitro. The possibility of direct morphogenesis induction under cultivation of stem, petiole and leaf explants was shown. The optimal conditions for different stage of micropropagation in meristem culture of geranium essential oil varieties have been determined.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить

По темам:

История Украины

Культурология

Высшая математика

Информатика

Охотоведение

Статистика

География

Военная наука

Английский язык

Генетика

Разное

Технологиеские темы

Украинский язык

Филология

Философия

Химия

Экология

Социология

Физическое воспитание

Растениевосдство

Педагогика

История

Психология

Религиоведение

Плодоводство

Экономические темы

Бухгалтерские темы

Маркетинг

Иностранные языки

Ветеринарная медицина

Технические темы

Землеустройство

Медицинские темы

Творчество

Лесное и парковое хозяйство