Статьи по растениеводческим темам
  • Регистрация
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 0.00 (0 Голоса)

УДК 575.22:633.791

БІОТЕХНОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ ПРОГНОЗУВАННЯ ЯКОСТІ САДИВНОГО МАТЕРІАЛУ (НА ПРИКЛАДІ HUMULUS LUPULUS L.)

МЕЛЬНИЧУК М. Д., доктор біологічних наук, член-кореспондент УААН (НУБіП України)

ОВЕРЧЕНКО В. В., асистент (НУБіП України)

КЛЮВАДЕНКО А. А., науковий співробітник (НУБіП України)

НОВАК Т. В., кандидат сільськогосподарських наук (НУБіП України)

Першочерговою передумовою одержання високих врожаїв хмелю звичайного (Humuluus lupulus L.) є отримання і впровадження у виробництво високоякісного садивного матеріалу з високою сортоспецифічністю та вільного від патогенів, зокрема вірусної природи [1, 2, 3].

В Україні виробництво хмелю сконцентровано в господарствах Поліської і Лісостепової зон, де грунтово-кліматичні умови найоптимальніше відповідають біологічним особливостям й дозволяють отримувати високоякісну сировину хмелю ароматичних і гірких сортів для забезпечення потреб вітчизняної пивоварної промисловості. Маючи потужну базу для вирощування хмелю, наша держава, на жаль, відчуває різке скорочення його виробництва через відсутність технічних засобів обробітку ґрунту, догляду, переробки хмелесировини, недосконалість технології вирощування та обмежену кількість якісного, конкурентоспроможного посадкового матеріалу. Тому необхідно вдосконалювати існуючі і створювати нові біотехнології вирощування сортів і гібридів, вчасно оновлювати плантації та вдосконалювати переробку шишок хмелю [3, 4, 5].

Патогени вірусної природи найбільшою мірою поширені на рослинах хмелю, які уражують їх у різних формах [6, 7]. У 80-х роках минулого століття було показано, що ураженість вірусами окремих сортів хмелю становить понад 90%, що призводить до значних втрат врожайності та погіршення якості хмелесировини. Важливо констатувати той факт, що часто хвороби протікають на рослинах хмелю в латентній формі [8, 9].

Протягом останніх 40 років в агроценозах України багатьма вченими виявлено понад 20 вірусів, що уражують рослини хмелю [10, 11]. Ще в 70-х роках минулого століття С. М. Московець та А. Л. Бойко встановили розповсюдження вірусів на хмільниках Житомирської області від 32 до 50 %, а в кінці 90-х років – 72% [6]. Найвірулентніші штами вірусів, що уражують хміль в Україні, відносять до груп Ilarvirus, Nepovirus та Carlavirus. Зовнішні симптоми, які проявляють уражені рослини хмелю дуже різноманітні і можуть бути чітко виражені і зовсім слабкими. Проте деякі рослини і навіть сорти та лінії хмелю є безсимптомними носіями вірусів, що локалізовані у латентній формі. До них відносять латентний вірус хмелю (ЛВХ), який є надзвичайно вірулентним і призводить до значних втрат врожаю та погіршення якості шишок хмелю [6, 7, 12].

Метод клонального мікророзмноження переважно розглядається як можливість вегетативного розмноження рослин та їх оздоровлення в умовах in vitro [7, 13, 14, 15]. Але коло використання його в останні роки значно розширено для клонової селекції, кріозбереження, створення генобанку рослин та отримання трансгенного матеріалу [16, 17, 18, 19].

Наявні методи клонального мікророзмноження рослин неможливо використовувати для культури хмелю без ретельного дослідження. При розмноженні нових видів і сортів хмелю in vitro виникає значна кількість труднощів на всіх етапах мікророзмноження, починаючи з добору первинного експлантату, отримання стерильної культури, оздоровлення, підбору компонентів та концентрацій живильного середовища на різних етапах морфогенезу. Особливо важливим етапом технології вирощування є укорінювання та адаптація до умов хмелеплантацій (in vivo). У разі запровадження ефективної біотехнології розмноження можливо прискорити селекційний процес, отримати генетично однорідний і оздоровлений посадковий матеріал, зменшити тривалість ювенільної фази та втрати врожаю хмелю [3, 13, 20].

До нинішнього часу в Україні практично не існувало високоточних і високоефективних молекулярних діагностикумів для детекції та ідентифікації вірусів, які уражують хміль. Особливої уваги привертає питання створення високоточної тест-системи для ідентифікації ЛВХ, якого важко діагностувати із-за відсутності зовнішніх симптомів ураження, надаючи при цьому, карантинний сертифікат при реєстрації нових сортів хмелю чи при реалізації посадкового матеріалу. Саме тому вирішення питання молекулярної ПЛР-діагностики ЛВХ відкриває можливості ефективно проводити його діагностику і створювати, як донорні плантації для масового розмноження перспективних сортів, а також якісно проводити реєстрацію нових та інтродукованих сортів хмелю в Україні.

Диференціація і ідентифікація сортів, ліній і гібридів сільсько-господарських рослин є важливим елементом селекції, насінництва та актуальною – у захисті авторських прав на сорти. Впровадження молекулярних методів прикладної вірусології і біотехнології, поряд з існуючими методами ідентифікації сортів рослин, дозволяє істотно їх доповнити та скоротити строки ідентифікації сорту за незначної потреби рослинного матеріалу (листки, корені, стебла, тощо), на будь-якій стадії онтогенезу, маючи за пробу мінімальну кількість екстрагованої ДНК рослини.

Тому дослідження в напрямку розробки молекулярних-діагностикумів на вірусну інфекцію ЛВХ та апробування методів SSR-ідентифікації генотипів рослин хмелю є актуальним для хмелярської галузі, з метою підвищення її конкурентоспроможності. В Україні генетичний поліморфізм послідовностей, що повторюються у рослин хмелю звичайного вивчений не ретельно, а молекулярні методи, що базуються на ДНК-маркерах до сьогодні для хмелю практично не існували. Деякі методи розроблені та апробовані в Україні лише для окремих сільськогосподарських культур. Звідси випливає пошук нових методичних і біотехнологічних підходів з метою підвищення врожаю та поліпшення якості сортів хмелю української селекції [21, 22].

Мета і завдання досліджень. Метою наших досліджень було діагностика вірусних хвороб, розробка сучасних методів ідентифікації вірусів цінних сортів хмелю (Humulus lupulus L.) вітчизняної селекції, вивчення морфогенетичних потенціалів ініціальних клітин, тканин й органів хмелю в умовах культури in vitro, вдосконалення технологій клонального мікророзмноження на безвірусній основі, розробка біотехнологічних підходів сортоідентифікації генотипів хмелю з використанням молекулярно-біологічних маркерів.

Матеріали і методи досліджень. Діагностику та ідентифікацію вірусів хмелю проводили в агроценозах Житомирської області на сортах української селекції. Для виявлення спектру чутливих рослин до досліджуваного вірусу, а також специфічних симптомів було проведено біологічне тестування на рослинах-індикаторах. Для виділення та очищення досліджуваного вірусу використовували молоде листя та молоді пагони, за стандартними методиками [8, 11]. Вивчення морфології вірусних частинок проводили електронно-мікроскопічним методом. Препарати переглядали в електронному мікроскопі JEM-1200 EX, при збільшенні 20-100 тисяч. Підготовку препаратів виділених вірусів проводили, використовуючи метод негативного контрастування. Електрофорез проводили за методикою [23].

Умови стерилізації рослинного матеріалу підбирали залежно від походження експлантату, що вводився, опрацьовували експозицію і концентрацію стерилізуючого агента. Для введення в культуру in vitro в якості первинного експлантату відбирали верхівкові бруньки (5-15 мм), міжвузля (15-25 мм), а також бруньки підземних етиольованих пагонів (5-15 мм). Для проліферації калюсної тканини хмелю використовували фрагменти стебел, міжвузля та листові пластинки рослин. Стерилізуючи речовини: 70% етиловий спирт (Укрзооветпромпостач, Україна), 20% розчин перекису водню Н2О2 (НВП «Альфарус», Україна), 0,1 % розчин сулеми HgCl2 (Сінбіас, Україна) та 5 % розчин гіпохлориту натрію NaCl (Сінбіас, Україна), які звільняли експлантати від бактеріальної та грибної інфекції. Асептичні умови створювали за загальноприйнятими в біотехнології методами [13, 14] і методами, розробленими в проблемній лабораторії фітовірусології та біотехнології НУБіП України. Асептичну роботу проводили в ламінарних боксах марки YLGH-19 (Німеччина). Для отримання безвірусних вихідних експлантатів рослин хмелю звичайного застосовували метод виділення апікальної меристеми [7;14]. Нами виділено три типи меристематичних експлантатів, за допомогою препаративних голок під стереомікроскопом МБС-9 (Росія), розміром 250-400, 400-550 та 550-800 мкм. Їх розміри визначали за допомогою мікрометра окулярного гвинтового (МОВ – 1-16Х (Росія)). Для підвищення відсотку безвірусних експлантатів використовували метод термотерапії. Адаптацію рослин до експериментальних умов теплової обробки починали з температури 250С, щоденно підвищуючи її на 20С протягом 6 діб до 37 ± 10С. Цей період вважали початком безпосередньо термотерапії. Запропоновано 3 періоди експозиції: 10, 20 та 30 діб.

Морфогенетичні потенції тканин та органів в умовах in vitro хмелю звичайного вивчали на базових живильних середовищах Мурасіге і Скуга (МС) [24] та Уайта [25], які в процесі експериментів модифікували. Для індукції проліферації органо - і калюсогенезу до складу живильного середовища вводили регулятори росту ауксинового (0,7-2,0 мг/л НОК, 0,5-2,0 мг/л ІМК, 0,5-1,5 мг/л 2,4-Д ) і цитокінінового типу дії (0,5-2,0 мг/л кінетину, 0,5-3,0 мг/л), гіберелову кіслоту (1,0-2,0 мг/л), гідролізат казеїну (500 мг/л) та мезоінозит (50 мг/л). При культивуванні на всіх етапах морфогенезу застосовували агаризоване середовище (вміст агару - 8 г/л), джерело вуглецю глюкозу (15-30 г/л) і сахарозу (30 г/л). Рослинний матеріал культивували на живильних середовищах у світловій кімнаті та термостаті ТС-80 (Україна) за температури +26(10С і освітленні 1000-3000 лк з 14-16-годинним фотоперіодом та 70-75% відносної вологості повітря (ВВП). Субкультивування ізольованих тканин і органів здійснювали кожні 20-30 діб.

Дослідження анатомічних показників і ультраструктури калюсних культур хмелю звичайного проводили за схемою: фіксація (3 % розчин глутарового альдегіду (Sigma, Німеччина) і 1% розчин OsO4 (Sigma, Німеччина)), зневоднення матеріалу (абсолютний ацетон (Sigma, Німеччина), етиловий спирт), заливання в епоксидну смолу (епон 812, епон DDSA, MNA, аральдит М, DMP–30), виготовлення препаратів (ультрамікротом LKB 8800 (Швеція)) і їх аналіз у світловому мікроскопі NU-2 (Росія), підрахунок клітин у калюсній культурі (камера Фукса-Розенталя) [7, 14].

Виділення ДНК проводили за методикою [26]. Полімеразну ланцюгову реакцію здійснювали в об’ємі реакційної суміші – 25 мкл (10х дНТФ, 5х ПЛР буфер 1,5-3 ммоль MgCl2, 1 од. TaqДНК-полімерази, АмплиСенс, Росія) із використанням 10 пкмоль кожної пари праймерів, 100 нг геномної ДНК хмелю. Ампліфікацію проводили на приладі Applied Biosystems 2400. Умови реакції: початкова денатурація 940С – 5 хв., потім 36 циклів за умов – денатурація 940С – 45 с., ренатурація (гібридизація) 630С – 1 хв. 30 с., елонгація 720С – 30 с., заключний цикл - фінальна елонгація 720С – 10 хв.

Розподіл продуктів ампліфікації здійснювали на ABI Prism 3130 генетичному аналізаторі. Суміш для капілярного електрофорезу включала 1 мкл розбавленого ПЛР-зразку, 11,5 мкл Hi-Di формаміда (Applied Biosystems) і 0,5 мкл Genescan-350 ROX стандарту (Applied Biosystems), яку аналізували згідно інструкції виробника. Розмір флуоресцентних мічених ПЛР-продуктів (у парах нуклеотидів) вивчали за допомогою комп’ютерної програми «Genescan» та «Genotyper». Експериментальний цифровий матеріал опрацьовували стандартними сучасними статистичними методами з використанням комп’ютерної програми Microsoft Excel.

Результати і обговорення. У результаті обстеження хмільників Житомирської області було виявлено симптоми скручування листя – на сортах хмелю Заграва, Потіївський, Промінь та Слов’янка; хлороз виявили лише на сорті хмелю Птіївський; міжжилкова мозаїка спостерігалася на Альті, Зміні, Кумирі, Промені та Регенті; енації – на Заграві і Слов’янці, карликовість – на Заграві, відповідно (рис. 1-4).

Рис. 1. Скручування листків хмелю, сорт Промінь

Рис. 2. Міжжилкова мозаїка,

сорт Кумир

Рис. 3. Хлороз та деформація листової пластинки, сорт Потіївський

Рис. 4. Карликовість рослин хмелю, сорт Заграва

Візуальна діагностика вірусних хвороб хмелю не завжди дозволяє зробити висновки про вірусну природу патогену. Дослідження безпосередньо зразків сортів Промінь, Заграва та Слов’янка показали, що з перерахованих рослин-індикаторів на квасолі відмічалися системні некрози деградації листків у відповідь на зараження латентним вірусом хмелю (рис. 5).

Рис. 5. Вірусспецифічні симптоми на рослинах квасолі,

що викликані латентним вірусом хмелю.

Для подальшої діагностики патогену вірус виділяли з листків хмелю та з пагонів молодих рослин, які швидше інфікуються, нагромаджують вірус у більшій концентрації, містять менше забарвлюючих сік речовин та ферментів, що ускладнюють очищення. Початковою стадією очищення фітовірусів є екстракція з рослинних тканин, ефективність якої залежить від умов гомогенізації. Було визначено, що гомогенати з листя хмелю мають здатність швидко окислюватись. За кімнатної температури вони миттєво з яскраво-зеленого забарвлення набувають темно-бурого. Тому, під час гомогенізації використовували рідкий азот і всі процедури виконували на холоді.

Під час проведення електронно-мікроскопічних аналізів зразків рослин нових сортів хмелю та рослин-індикаторів у препаратах було виявлено вірусні частки ниткоподібної форми розмірами 630-640 х 12 нм з внутрішнім каналом 3,5-3,7 нм, що повністю відповідають характеристикам ВСЛХ (рис. 6). та розмірами 670 х 19 нм із внутрішнім каналом 3,5-3,7 нм (рис. 7). Причому у кожному шостому випадку вірусний патоген був виявлений із рослин хмелю, які зовсім не утворювали зовнішніх симптомів.

вирус

Рис. 6. Електронографія карлавірусу листків сорту хмелю Кумир, виділеного із соку інфікованих рослин

Рис. 7. Ниткоподібна частка латентного вірусу хмелю з безсимптомної рослини хмелю (стрілкою показано ЛВХ)

Для отримання безвірусного рослинного матеріалу, який у подальшому використовували для клонального мікророзмноження, нами обрано методику виділення апікальної меристеми. Зокрема, запропоновано використання трьох типів меристематичних експлантатів, які розподіляли за розмірами: І тип (меристема з 2-3 листковими примордіями) - ~250 до 400 мкм, ІІ тип (меристема з примордіями та частково меристематична зона) – ~400 до 550 мкм, ІІІ тип (меристематична зона) - від ~550 до 800 мкм (рис. 8).

Оптимальнішим, на нашу думку, слід вважати використання експлантатів з апікальної зони рослин хмелю ІІ типу, адже саме ці розміри дозволили оптимально використати регенераційну здатність тканин (64-76%) та звільнити їх від вірусного патогену (56-60%). Для підвищення коефіцієнта отримання безвірусного рослинного матеріалу нами запропоновано використати методику термотерапії. При накладанні умов термотерапії на метод апікальних меристем спостерігали аналогічну картину щодо прояву морфогенетичної здатності апексів обох сортів хмелю.

Отримані нами результати показали, що поєднання методів термотерапії (час експозиції 20 діб за температурі 37±10С) і виділення апікальної меристеми (меристема з примордіями та частково меристематична зона в 400-550 мкм) дає змогу отримати 75 - 90 % оздоровленого рослинного матеріалу.

Рис. 8. Апікальна меристема сорту хмелю Гайдамацький з листковими примордіями.

Оптимальним періодом для відбору вегетативних бруньок з надземної частини рослин в агроценозах є період з травня до середини липня місяця. При відборі зимуючих бруньок кореневищ для використання їх в якості первинних експлантатів при введенні в культуру in vitro цей період припадає на квітень місяць. Найвищим морфогенетичним потенціалом відзначено вегетативні бруньки верхівок та етиольованих пагонів хмелю. Нами запропоновано спосіб отримання асептичної культури вегетативних бруньок та сегментів стебла сортів хмелю із використанням 0,1 % розчину сулеми (HgCl2) з експозицією 7 хвилин, що дозволяє одержувати стерильний матеріал з високою регенераційною здатністю (біля 90 % зразків). Результатами чисельних дослідів з вивчення морфогенетичного потенціалу тканин та органів хмелю в умовах in vitro доведено щодо доцільності використання, як базового, живильного середовища МС. Оптимальним співвідношенням регуляторів росту для активізації пазушних меристем і росту мікропагонів є БАП у концентрації 1,0 мг/л для експлантатів сорту хмелю Кумир й 1,5 мг/л – Гайдамацький та Національний та ГК у концентрації 1,0 мг/л для трьох сортів (рис. 3, 4).

Рис. 9. Вплив різних концентрацій БАП на активізацію пазушних меристем сортів хмелю

Рис. 10. Вплив різних концентрацій БАП на ріст пагонів сортів хмелю

Нами в серії експериментів досліджено також процеси індукції, розвитку та фізіологічні особливості калюсогенезу хмелю звичайного. Вивчено інтенсивність формування калюсу на різних типах експлантатів (міжвузля, листок, стебло) та отримано морфогенний калюс сорту хмелю Гайдамацький із високою регенераційною здатністю. Цитологічним аналізом підтверджено гетерогенну структуру неморфогенного калюсу та виявлено меристематичні зони в морфогенному калюсі хмелю звичайного (рис. 11).

Рис. 11. Меристематичні зони (М) в калюсі сорту хмелю Гайдамацький пасаж)

В процесі дослідження індукції ризогенезу показано вплив різних концентрацій фітогормонів, мінеральних та органічних сполук живильного середовища на формування кореневої системи. Доведено, що оптимальним живильним середовищем для укорінювання мікропагонів хмелю є середовище з вмістом 0,1 мг/л БАП + 2,0 мг/л ІМК для рослин сорту хмелю Кумир та 0,1 мг/л БАП + 1,5 мг/л ІМК - Гайдамацький та Національний, максимальний відсоток укорінення рослин досягав 100 %. Виявлено залежність частоти коренеутворення від інтенсивності освітлення. Найбільший відсоток укорінення відбувався за інтенсивності освітлення 2500 лк – 95 %, який різко знижувався при підвищенні інтенсивності освітлення.

Модифікуючи класичну схему отримання безвірусного садивного матеріалу, нами запропоновано технологічні операції з урахуванням матеріально-технічного забезпечення хмелярських господарств та подальшого розвитку галузі (рис. 12).

Рис. 12. Загальна схема одержання мериклонів хмелю звичайного.

Для генетичного аналізу застосовували 10 мікросателітних відомих локусів (11a-59, 7a-82, HlG-A3, HlG-T1, HlG-T5, 3a-88, 5-2, HlG-A4, HlG-A9, HlG-T2). Було встановлено, що 9 із 10 локусів є поліморфними, за винятком локусу 7a-82, який виявився мономорфним для генотипів хмелю. Проведеним ПЛР аналізом виявлено 45 алелів. Результати диференціації мікросателітних локусів за довжиною алелів представлено в табл. 1.

Доведено, що найменша кількість алелів міститься в локусах 11a-59 і 7a-82, два алеля з розмірами 179 й 190 пар нуклеотидів у першому, 196 та 198 - другому локусі. Під час аналізу генотипів хмелю із праймерами до мікросателітних локусів 3a-88 і 5-2 визначили сім алелів з диференційованими розмірами (191, 193, 196, 198, 200, 219, 223 та 149, 168, 176, 179, 181, 183 та 185 пар нуклеотидів відповідно). Три алеля зафіксовано за допомогою електрофоретичного аналізу продуктів ампліфікації з праймерами до мікросателітних локусів HlG-A3, чотири в локусах HlG-A4 і HlG-T2, п’ять у HlG-T1 та HlG-A9, шість у HlG-T5. Середня кількість алелів на один генотип становить 4,5.

Таблиця 1

Алелі мікросателітних локусів, виявлених при генотипуванні 13 сортів хмелю звичайного української селекції

Локус

Алелі

Кількість алелів, шт.

РІС

A

B

C

D

E

F

G

11a-59

179

190

2

0,50

7a-82

196

198

2

-

HlG-A3

147

150

156

3

0,46

HlG-T1

254

260

262

264

266

5

0,64

HlG-T5

187

198

201

208

212

232

6

0,68

3a-88

191

193

196

198

200

219

223

7

0,72

5-2

149

168

176

179

181

183

185

7

0,77

HlG-A4

225

232

234

241

4

0,62

HlG-A9

194

216

218

220

226

5

0,73

HlG-T2

212

214

218

220

4

0,59

Загальна кількість алелів

45

Середня кількість алелів на один мікросателітний локус

4,5

Для спрощеного запису генотипів рослин хмелю визначено алелі залежно від їхнього розміру, які позначали латинськими літерами A, B, C, D, E, F, G, де А – найменший за розмірами алель при електрофоретичному розподілі продуктів ампліфікації, літера В відповідає наступному за розміром алелю, G – найбільший фрагмент у мікросателітних локусах 3a-88 та 5-2. У результаті такого кодування можливо створити комп’ютерну базу сортів хмелю української селекції.

У результаті експериментального визначення оптимальної концентрації компонентів ПЛР-суміші, підбору оптимальних умов для проведення ампліфікації та уніфікації всього процесу ПЛР, було запропоновано проведення мультиплексного ампліфікування генотипів хмелю з комплексом мікросателітних маркерів, що, у свою чергу, дозволило суттєво зекономити витрату реактивів на проведення досліджень та скоротити час аналізу. Для створення мультиплексу було проаналізовано мінімальні і максимальні довжини отриманих мікросателітних локусів (найбільший і найменший розмір кожного локусу) та барвник, яким фарбували SSR-маркери. Для виконання мультиплексу брали лише 9 із 10 мікросателітних маркерів, бо другий 7а-82 виявився моноалельним. Для оптимізації умов проведення ПЛР у першу чергу підбирали температуру відпалу праймерів. Експериментальним шляхом встановлено, що оптимальні умови проведення полімеразної ланцюгової реакції генотипів хмелю з SSR-маркерами мають відповідні параметри (табл. 2).

Таблиця 2

Умови та параметри ампліфікації

Ампліфікатори з активним регулюванням температури

(за об'ємом рідини в пробірці – 25 мкл)

Температура, оС

Час

Кількість циклів

94

5 хв

1

94

45 с

36

63

1хв 30с

72

30 с

72

10 хв

1

4

зберігання

Візуалізацію продуктів ампліфікації за використання мультиплексної комбінації маркерів з різними величинами ампліфікованих локусів здійснювали за допомогою генетичного аналізатора ABI Prism 3130

Експериментально встановлено, що сорт хмелю Руслан містить 23 алеля, Тріумф – 20, Національний – 17, Славянка – 12, Кумир – 15, Промінь – 19, Злато Полісся – 17, Оболонський – 18, Хмелеслав – 14, Альта – 14, Потіївський – 18, Гайдамацький – 21 та Заграва – 18 (табл. 3).

Таблиця 3

Результати генотипування 13 сортів за 10 мікросателітними локусами

Маркер

Алель

Сорт

Руслан

Тріумф

Національний

Слов’янка

Кумир

Промінь

Злато Полісся

Оболонський

Хмелеслав

Альта

Потіївський

Гайдамацький

Заграва

11a-59

А

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

B

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

7a-82

A

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

B

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

HlG-A3

A

+

+

+

B

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

C

+

+

HlG-T1

A

+

+

+

+

B

+

C

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

D

+

+

E

+

+

+

HlG-T5

A

+

B

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

C

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

D

+

+

+

E

+

3a-88

A

+

+

B

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

C

+

D

+

+

+

+

+

E

+

F

+

+

+

G

+

5-2

A

+

+

+

B

+

C

+

+

+

+

+

D

+

+

+

+

+

+

+

+

+

E

+

F

+

G

+

+

+

+

+

+

HlG-A4

A

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

B

+

+

+

C

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

D

HlG-A9

A

+

+

+

+

+

B

+

C

+

+

+

+

+

D

+

+

+

+

+

E

+

HlG-T2

A

+

+

+

+

+

+

+

+

+

B

+

C

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

D

+

Для створення комп’ютерного банку генетичних паспортів сортів хмелю української селекції було переведено отримані дані в бінарний вираз. Наявність або відсутність певного алеля позначається як «1» або «0». За таким принципом можливо побудувати генетичний паспорт геному хмеля (табл. 4). Це дозволяє легко ідентифікувати і диференціювати проаналізовані, за даними 10 мікросателітними локусами, сорти та вихідний селекційний матеріал хмелю. Як показав аналіз сортів хмелю за 10 SSR-маркерами кожний представлений генотип має власний і унікальний набір алелів. Це дозволяє чітко розрізняти їх при проведенні SSR-ПЛР аналізу.

Таблиця 4

Бінарний генетичний код 13 сортів хмелю звичайного української селекції

Сорт

Генетична формула

Руслан

11111110011001100010001010001011010101001010

Тріумф

11111011010001100011000000110001010001101010

Національний

11110101010001100010000000010011010000110010

Слов’янка

10110100000001100010000000010011010000000010

Кумир

01110100010011000010001000000001010101001010

Промінь

11110100011001100010100010110001010001100010

Злато Полісся

11110100010001100110000000110000110000001100

Оболонський

11110100010101101100100000010010110000000010

Хмелеслав

11111100000001100010101000000100010100001000

Альта

11110100000001100000000000110001010010001001

Потіївський

11110100010101110000110001000011010000001010

Гайдамацький

11110100110001110010000110110011110000001010

Заграва

11110100010101100010100000010011010001001010

Запропонована система генотипування дозволяє створити комп’ютерний банк даних генетичних паспортів всіх сортів хмелю української селекції, а також вихідного селекційного матеріалу. Після того, як буде створений розширений банк даних, можна легко і з високою ймовірністю проводити ідентифікацію та диференціацію сортів хмелю. Цим методом можна скористатись при проведенні також арбітражних досліджень при ідентифікації сорту, його реєстрації в Держслужбі та при захисті прав селекціонерів.

Висновки. Розроблено технологію клонального мікророзмноження in vitro хмелю звичайного, яку рекомендується використовувати для масового розмноження з метою ефективного оздоровлення та одержання генетично однорідного рослинного матеріалу. Практичні результати з непрямого морфогенезу можуть бути використані при створенні нових селекційних форм та трансгенних рослин хмелю звичайного. ДНК-ідентифікації та диференціації сортів хмелю української селекції на основі 10 SSR-маркерів відкриває нові можливості і дозволяє проводити сортоідентифікацію отриманих безвірусних регенерантів на етапі клонального мікророзмноження, а також дає можливість суттєво скоротити час проведення визначення будь-якого сорту хмелю. Результати досліджень свідчать про високу ідентифікаційну та диференційну здатність розробленої системи генотипування. Запропоновано варіант запису молекулярно-генетичного паспорта генотипу за допомогою бінарних формул, який засвідчує відміни структури ДНК сорту, лінії, гібриду і дозволяє здійснювати унікальну ідентифікацію сортів хмелю звичайного.

Список літератури

1.  Бойко А. Л. Вирусы и вирусные заболевания хмеля и розы эфиромасличной / Бойко А. Л. - К.: Наукова думка. - 1976. – 148с.

2.  Кормильцев Б. Ф. Використання методу культури апікальних меристем для оздоровлення хмелю від деяких вірусів / Б. Ф. Кормильцев, А. Л. Бойко, А. Т. Горшкова // Хмелярство. – 1992. – Вип. 14. - С. 20 – 22.

3.  Мельничук М. Д. Отримання безвірусного посадкового матеріалу хмелю (Humulus lupulus L.) в умовах in vitro / М. Д. Мельничук, А. А. Клюваденко, О. А. Давиденко // Науковий вісник НАУ. – 2000. – Вип. 29. – С. 47-52.

4.  Юрківський О. Й. Вплив світових тенденцій на розвиток ринку хмелю України / О. Й. Юрківський // Хмелярство: міжвідомчий тематичний науковий збірник. – К.: Аграрна наука, 2005. – № 22. – С. 106–113.

5.  Ратошнюк Т. М. Сучасний стан та перспективи розвитку галузі хмелярства в Житомирський області / Т. М. Ратошнюк, В. С. Кудинський, О. М. Николюк // Хмелярство: міжвідомчий тематичний науковий збірник. – Броди: Просвіта, 2006. – № 23. – С. 127–132.

6.  Мельничук М. Д. Методичні підходи по виділенню та очистці карлавірусу хмелю на плантаціях світової колекції в Україні / Мельничук М. Д., Кожукало В. Є., Оверченко В. В., Смирнова С. О. // Аграрна наука та освіта. – 2001, № 1, Т. 2. – С. 5 – 10.

7.  Adams A. N. Most range, purification and some properties of hop mosaic virus. / Adams A. N., Barbara D. G. //Ann. Appl. Biol – 1980 – Vol. 96. – P. 201-208.

8.  Adams A. N. Most range, purtification and some properties of two carlaviruses from hop (Humulus lupulus): hop latent American, hop latent. / Adams A. N., Barbara D. G. // Ann appl. Biol. – 1982. – Vol. 101. – Р. 483 -494.

9.  Hataya T. Molecular characterization of Hop latent virus and phylogenetic relationships among viruses closely related to carlaviruses. / Hataya T., Uchino K., Arimoto R. // Arch. Virol. – 2000. - Vol. 145. - P. 2503 – 2524.

10.  Московець С. М. Вірусні захворювання хмелю і заходи боротьби з ними / Московець С. М., Бойко А. Л. – К., - 1970. – 36 с.

11.  Мельничук М. Д. Діагностика та ідентифікація вірусів хмелю (Humulus lupulus L.) новітньої української селекції / М. Д. Мельничук, С. О. Смирнова, В. Є. Кожукало, В. В. Оверченко // Бюлетень Інституту Сільськогосподарської Мікробіології. – 2000. - №7, - С. 37-38.

12.  Barbara D. J. Hop latent virus. / Barbara D. J., Adams A. N. // CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses. - 1983. - № 261.

13.  Бутенко Р. Г. Культура клеток растений и біотехнологія / Р. Г. Бутенко. – М.: Наука, 1986. – 285 с.

14.  Калинин Ф. Л. Технология микроклонального размножения растений / Ф. Л. Калинин, Г. П. Кушнир, В. В. Сарнацкая. – К.: Наукова думка, 1992. – 232 с.

15.  Митрофанова О. В. Вирусные болезни промышленных цветочных культур и биотехнологические приемы их оздоровления : автореф. дис… доктора біол. наук : спец. 06.01.11 / Митрофанова Ольга Владимировна. – РАСХН. – СПб., 1992. – 72 с.

16.  Batista D. Efficient and stable transformation of hop (Humulus lupulus L.) var. Eroica by particle bombardment / D. Batista, S. Fonseca, S. Serrazina, A. Figueiredo, M. Salome´ Pais // Plant Cell Rep. – 2008. – № 27. – Р. 1185–1196.

17.  Fortes A. M. Organogenesis from internode-derived nodules of Humulus lupulus var. Nugget (Cannabinaceae): histological studies and changes in the starch content / A. M. Fortes, M. S. Pais // Am J Bot. – 2000. – № 87. – P. 971–979.

18.  Horlemann C. Regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of hop (Humulus lupulus L.) / C. Horlemann, A. Schwekendiek, M. Hohnle, G. Weber // Plant Cell Rep. – 2003. – № 22. – Р. 210–217.

19.  Peredo E. L. Genetic and epigenetic stability of cryopreserved and cold-stored hops (Humulus lupulus L.) / EL. Peredo, R. Arroyo-García, BM. Reed, MA. Revilla // Cryobiology. – 2008. – Vol. 57, № 3. – Р. 234–241.

20.  Silva M. F. Differential expression and cellular localization of ERKs during organogenic nodule formation from internodes of Humulus lupulus var. Nugget / M. F. Silva, A. M. Fortes, P. Testillano, M. Risueño, M. S. Pais // Eur J Cell Biol. – 2004. – № 83. – P. 425–433.

21.  Шабранський А. С. Довідник з хмелярства / А. С. Шабранський, В. М. Шуляр, М. Г. Ковтун. – Житомир: Полісся, – 2000. – 120 с.

22.  Мельничук М. Д. Молекулярно-біологічне вивчення геномних і реплікативних рнк фіто - та міковірусів як основа для створення рослинних біотехнологій : дис. … доктора біол. наук: 03.00.06, 03.00.20/ Мельничук Максим Дмитрович. – К., 2006. – 297 с.

23.  Laemmli U. K. Cleavege of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. / Laemmli U. K. // Nature. – 1970. – Vol. 227. – P. 680-685.

24.  Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. A. Skoog //Physiol. Plant. – 1962. – №15. – Р. 473–497.

25.  White Ph. R. A handbook of plant tissue culture. – Lancaster: The jacques catlell press, 1943. – 191 p.

26.  Boom R. Rapid and simple methods for purification of nucleic acids / Boom R., Soi CJA., Salimans МM // J. Clin Microbiol. – 1990. - Vol. 28. - Р. 495-503.

УДК 575.22:633.791

Мельничук М. Д., Оверченко В. В., Клюваденко А. А., Новак Т. В. Біотехнологічні аспекти прогнозування якості садивного матеріалу (на прикладі Humulus lupulus L.)

Показані біотехнологічні підходи ідентифікації вірусів хмелю, клонального мікророзмноження, вивчення морфогенетичного потенціалу органів і тканин хмелю звичайного в умовах in vitro, визначення сортоспецифічності регенерантів та диференціації генотипів за ДНК-маркерами.

УДК 575.22:633.791

Мельничук М. Д., Оверченко В. В., Клюваденко А. А., Новак Т. В. Биотехнологические аспекты прогнозирования качества посадочного материала (на примере Humulus lupulus L.)

Показаны биотехнологические подходы идентификации вирусов хмеля, клонального микроразмножения, изучения морфогенетичного потенциала органов и тканей хмеля обычного в условиях in vitro, определения сортоспецифичности регенерантов и дифференциации генотипов за маркерами ДНК.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить

По темам:

История Украины

Культурология

Высшая математика

Информатика

Охотоведение

Статистика

География

Военная наука

Английский язык

Генетика

Разное

Технологиеские темы

Украинский язык

Филология

Философия

Химия

Экология

Социология

Физическое воспитание

Растениевосдство

Педагогика

История

Психология

Религиоведение

Плодоводство

Экономические темы

Бухгалтерские темы

Маркетинг

Иностранные языки

Ветеринарная медицина

Технические темы

Землеустройство

Медицинские темы

Творчество

Лесное и парковое хозяйство