Лісова генетика. Навчальний посібник. Г.Г. Баранецький, Р.М. Гречаник. 2003 р.
  • Регистрация
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 0.00 (0 Голоса)

4.2. Дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК)

У клітині знаходиться один вид ДНК.

Кількість ДНК протягом життя клітини стала.

ДНК знаходиться у клітині в ядрі, мітохондріях, пластидах зелених рослин. (Спостереження подвоєння центріолей привели деяких дослідників до уявлення, що центріолі так само, як мітохондрії і пластиди, належать до саморедуплікуючих компонентів цитоплазми, хоча прямих даних про наявність ДНК у складі центріолей ще немає).

"Будівельними блоками", з яких побудована молекула ДНК, є нуклео-тиди. Кожний нуклеотид складається з пуринової або пірамідинової основи, з'єднаної з вуглеводом дезоксирибозою, яка з'єднана із залишком фосфорної кислоти. Пуринові основи – аденін і гуанін; пірамідинові основи – цитозин і тимін. Кожна пуринова або пірамідинова основа зв'язана своїм атомом 9-N або 1- N з атомом 1'-С дезоксирибози, а атом 5'-С дезоксирибози етерифікований фосфатом.

Гідроксильна група (ОН) в атомі 3'-С дезоксирибози одного нуклеотиду може етерифікуватися фосфатом іншого нуклеотиду, і в результаті утворюється динуклеотид. Таким чином, приблизно від 70 до > 108 нуклеотидів зв'язуються в полінуклеотидний ланцюг. Осьовий скелет такої молекули складається із залишків фосфата і дезоксирибози, які чергуються, тоді як основи приєднані збоку. Всі пентозні дезоксирибози, залишки одного ланцюга, орієнтовані атомом 5'-С в одному напрямі, а атомом З'-С – у протилежному. Таким чином, кожний ланцюг полярний: він має 5'-кінець (фосфатний кінець) і З'-кінець (гідроксильний кінець).

описание: _18

Рис. 4.1. Нуклеотид (дезоксиаденозин-5'-фосфат) [8]

Молекули ДНК складаються приблизно з 2000 – 108 і більше моно-нуклеотидів. У кожній молекулі два полінуклеотидні ланцюги об'єднані в один подвійний ланцюг. Основи розташовані парами одна проти іншої і з'єднані водневими зв'язками. Через стереохімічні причини до утворення пар здатні тільки комплементарні (які підходять одне до іншого) основи: аденін і тимін з'єднуються між собою двома, а гуанін і цитозин – трьома водневими зв'язками. Два ланцюги розташовуються антипаралельно: 5'-кінець одного ланцюга лежить навпроти З'-кінця іншого ланцюга. Ланцюги комплементарні за основами: наприклад, послідовності 5'-А-Г-Ц-Ц-Т-З' протистоїть у другому ланцюгу послідовність 3'-Т-Ц-Г-Г-А-5'. Внаслідок комплементарності основ у кожному подвійному ланцюгу кількість А дорівнює кількості Т, а кількість Г – кількості Ц. Водночас так зване співвідношення основ А+Т/Г+Ц – видоспецифічне.

У вірусів ланцюг ДНК теж подвійний, тільки в деяких фагів (віруси бактерій) є одноланцюгова ДНК.

Геометрія подвійної спіралі така, що сусідні пари основ знаходяться одна від одної на відстані 0,34 нм і повернуті на 36 ° навколо осі спіралі. На один виток спіралі припадає, таким чином, 10 пар основ360 ° / 36 °= 10, і крок спіралі дорівнює 3,4 нм. Діаметр подвійної спіралі ДНК дорівнює приблизно 20 нм. У подвійній спіралі ДНК утворюються жолобки. Це пов'язано з тим, що вуглеводнофосфатний стовбур розташований далі від осі спіралі, ніж основи. У подвійній спіралі є два жолобки – великий і малий.

Рентгенограми волокон ДНК, одержані Франкліном і Уілкінсом між 1950 і 1953 роками, дали дуже важливу для побудови подвійної спіралі інформацію. Ідеалізована дифракційна картина має вигляд хреста із рефлексів (плям), який утворюється через регулярну структуру ДНК. Відстань між шаровими лініями відповідає періоду 3,4 нм, тобто кроку подвійної спіралі, а сильний рефлекс (пляма) на 10-ій шаровій лінії – періоду 0,34 нм, тобто відстані між парами основ. Ці параметри відносяться до В-форми ДНК.

Стабільність подвійної спіралі зумовлена різними взаємодіями. Частково за неї відповідальні водневі зв'язки між основами. Але, напевно, більш важливу роль відіграє міжплощинна взаємодія – стекінг. При цьому забезпечуються не тільки вигідні вандервальсові контакти між атомами, але і виникає додаткова стабілізація завдяки перекриванню П-орбіталей атомів контактуючих основ. Стабілізація здійснюється також за рахунок сприятливого гідрофобного ефекту, який виявляється в тому, що неполярні основи захищені від безпосереднього контакту з розчинником. Навпаки, вуглеводнофосфатний стовбур з його полярними групами і зарядженими атомами експонований, що також стабілізує структуру.

Поліморфізм ДНК – це здатність подвійної спіралі набирати різної конформації. Рентгеноструктурні дослідження кристалів полінуклеотидів (коротких полінуклеотидів, так званих олігонуклеотидів) виявили 3 основних типи структур: А-, В-, Z-форми. В-ДНК – це стандартна уотсон-кріківська структура, в якій площини пар основ перпендикулярні до осі подвійної спіралі. В А-ДНК площини пар основ повернуті приблизно на 20 ° від нормалі до осі правої спіралі. На виток спіралі тут припадає 11 пар основ. А-ДНК утворюється при висушуванні волокон В-ДНК. Z-ДНК – це ліва спіраль з 12 парами основ на виток. Буква 2 вказує на зигзагоподібну форму вуглеводнофосфатного стовбура ДНК у цій формі. Площини основ приблизно перпендикулярні до осі спіралі. У клітині ДНК звичайно знаходиться в В-формі, але окремі її ділянки можуть знаходитися в А-, Z - або навіть в іншій конформації. (Утворення Z-форми, хрестоподібних і інших структур стимулюється надспіралізацією ДНК).

Структура ДНК. Молекула ДНК містить інформативні ділянки. В інформативних ділянках послідовність основ (первинна структура) являє собою матеріальний еквівалент генетичної інформації. Кожне повідомлення закодовано специфічною послідовністю із чотирьох знаків – А, Г, Ц, Т, подібно до того, як письмові повідомлення кодуються знаками (буквами) алфавіту або азбуки Морзе. Вторинна структура ДНК – це подвійна спіраль: два полінуклеотидних ланцюги закручені навколо загальної (спільної) уявної осі, й між ними утворюються два спіральні жолобки (борозенки) неоднакової глибини. Подвійна спіраль стабілізована водневими зв'язками і гідрофобними взаємодіями. У хромосомах подвійні спіралі утворюють тяжі з двома кінцями. Подвійні спіралі ДНК, які знаходяться в цитоплазматичних органелах (мітохондріях і пластидах) та в без'ядерних (прокаріотичних) організмів, замкнуті в кільце, яке може бути "зім'яте" в клубок.

описание: _06

Рис. 4.2. Будова ДНК: А-схема подвійної спіралі; Б-права спіраль; В-ліва спіраль [8]

описание: _04

Рис. 4.3. Сегмент молекули ДНК: дві комплементарні пари основ (цитозин-гуанін та аденін-тимін), сполучені водневими зв'язками [11]

У хромосомах подвійні спіралі з'єднані з білками (в основному іонними зв'язками) і утворюють разом з ними третинну структуру (суперспіраль у нуклеосомах, а також структури більш високого порядку).

Денатурація ДНК. Структуру подвійної спіралі ДНК (або РНК), укріплену водневими зв'язками, можна зруйнувати нагріванням. Оскільки спарені ланцюги не зв'язані між собою ковалентно, після розриву всіх водневих зв'язків два полінуклеотидні ланцюги ДНК повністю розділяються. Процес розділення ланцюгів називають денатурацією або плавленням. Денатурація відбувається у вузькому інтервалі температур і відображається в кардинальній зміні багатьох фізичних властивостей ДНК. Особливо корисною виявилася зміна оптичної густини. Гетероциклічні кільця нуклеотидів поглинають світло в ультрафіолетовій ділянці (з максимумом близько 260 мкм, характерним кожній основі). Але поглинання, характерне самій ДНК, майже на 40 % менше, ніж поглинання суміші вільних нуклеотидів того самого складу. Це явище, яке називають гіпохромним ефектом, зумовлене взаємодією електронних систем основ у результаті їх стекінг-взаємодій при паралельному розташуванні в подвійній спіралі. Будь-яке відхилення від двоспірального стану відразу виявляється у зміні величини цього ефекту. Іншими словами, відбувається зсув оптичної густини в бік значення, характерного для вільних основ.

Таким чином, за денатурацією ДНК можна спостерігати, досліджуючи її гіперхромність. Середню точку температурного діапазону, при якій проходить розділення ланцюгів ДНК, називають точкою плавлення і позначають Тпл. Крива плавлення має завжди одну і ту саму форму, але її положення на температурній шкалі залежить від складу основ ДНК і умов, що використовуються для денатурації. Коли ДНК знаходиться в розчині приблизно в фізіологічних умовах, Тпл лежить у діапазоні 85‑95 °С. Точне значення залежить від складу основ. Пари Г-Ц, зв'язані трьома водневими зв'язками, мають велику вільну енергію утворення і виявляються більш тугоплавкими, ніж пари А-Т, що зв'язані двома водневими зв'язками. Залежність Тпл від складу основ лінійна. При кожному збільшенні вмісту Г-Ц-пар значення Тпл збільшується на 0,4 °С. Так, ДНК, на 40 % складена із Г-Ц (що типово, наприклад, для геному ссавців), буде денатурувати при Тпл близько 87 °С у звичайних умовах, тоді як ДНК, що містить 60 % Г-Ц, за цих самих умов буде мати Тпл близько 95 °С. Вирішальний вплив на Тпл виявляє іонна сила розчину. Тпл зростає на 16,6 °С при кожному десятикратному збільшенні концентрації моновалентних катіонів. Частіше всього реакцію проводять у 0,12 М фосфатному буфері, що забезпечує концентрацію моновалентних іонів Nа+, рівну 0,18 М.

Значення Тпл сильно змінюється при добавленні в реакційну суміш таких речовин, як формамід, які дестабілізують водневі зв'язки. Їх присутність дозволяє знизити Тпл до 40 °С і цим самим запобігти додаткових пошкоджень ДНК (таких, як розрив ланцюгів), що викликаються підвищенням температури.

Надзвичайно корисна властивість денатурації ДНК – оборотність процесу. За певних умов два розділені комплементарні ланцюги можуть відновити подвійну спіраль. Це явище називають ренатурацією. Ренатурація залежить від специфічності спарювання основ між комплементарними ланцюгами. Реакція відбувається у дві стадії. Спочатку короткі комплементарні послідовності двох ланцюгів випадково з'єднуються одна з одною та утворюють двоспіральну ділянку. Потім ділянка спарювання, подібно до замка блискавки, поширюється вздовж молекули та утворюється довга дволанцюгова структура. Реконструкція подвійної спіралі завершується відновленням початкових властивостей, втрачених при денатурації ДНК. Швидкість ренатурації тим більша, чим більша однорідність ДНК за нуклеотидним складом.

У 1950 р. Е. Чаргофф і його співробітники, досліджуючи склад ДНК методом хроматографії, вперше встановили такі основні закономірності кількісного складу азотистих основ у ДНК:

1. Сума пуринових основ (А+Г) дорівнює сумі пірамідинових (Т+Ц).

2. Кількість основ з аміногрупами (А+Ц) дорівнює кількості основ з кетогрупами (Г+Т).

3. Молярні відношення пуринів до пірамідинів близькі до 1 (А=Т і Г=Ц), тобто знаходяться в еквімолярних кількостях. Це положення має важливе значення при формуванні подвійної спіралі ДНК і відоме як Правило еквівалентності.

Нуклеотидний склад ДНК в організмів різних таксономічних груп специфічний і визначається співвідношенням (Г + Ц) / (А + Т). Це співвідношення називають Коефіцієнтом специфічності. За допомогою коефіцієнта специфічності був визначений ступінь гетерогенності нуклеотидного складу ДНК в організмів різного походження. Так, у вищих рослин і тварин відношення (Г + Ц) / (А + Т) коливається незначно і має значення більше 1. Для мікроорганізмів коефіцієнт специфічності змінюється в широких межах – від 0,35 до 2,70. Разом з тим, соматичні клітини даного біологічного виду містять ДНК одного і того самого нуклеотидного складу, тобто можна сказати, що за вмістом Г-Ц-пар основ ДНК одного виду ідентичні. Визначення гетерогенності нуклеотидного складу ДНК за коефіцієнтом специфічності ще не дає інформації про її біологічні властивості. Останнє зумовлено різною послідовністю окремих нуклеотидних ділянок у полінуклеотидному ланцюгу. Це значить, що генетична інформація у молекулах ДНК закодована в специфічній послідовності її мономерних одиниць. Таким чином, нуклеотидна послідовність має важливе значення для визначення тонкої структури геному. ДНК містить нуклеотидні послідовності, на значенні ініціації і термінації процесів синтезу ДНК (реплікація), синтезу РНК (транскрипція), синтезу білка (трансляція). Є нуклеотидні послідовності, які слугують для зв'язування специфічних активуючих і інгибуючих регуляторних молекул, а також нуклеотидні послідовності, що не несуть якої-небудь інформації. Існують такі модифіковані ділянки, які захищають молекулу від дії нуклеаз.

Передумовою для збереження наявної спадкової інформації в ряді послідовних поколінь клітин і організмів є ідентичне подвоєння, або реплікація генетичного матеріалу. Реплікація ДНК відбувається перед кожним нормальним діленням структур, що містять ДНК (ядер, пластид і мітохондрій) у еукаріот, перед кожним діленням бактеріальних клітин і при розмноженні ДНК-вірусів. Як елементарні блоки для побудови нової ДНК у клітині синтезуються трифосфати чотирьох дезоксирибонуклеозидів – А Г, А Ц, А Т і А А.

описание: _14

Рис. 4.4. Схема напівконсервативної реплікації ДНК [8]

Матрицею (шаблоном) для синтезу ДНК слугує наявна видоспецифічна дволанцюгова молекула ДНК (рис. 4.4). До обох ланцюгів прибудовуються комплементарні нуклеозидтрифосфати за принципом спарювання основ. За допомогою полімераз вони зв'язуються у новий нуклеотидний ланцюг, причому від кожного з них відщеплюється пірофосфат. Таким чином, на кожному ланцюгу старої молекули утворюється новий комплементарний ланцюг; реплікація відбувається, як кажуть, напівконсервативним способом. При редуплікації з однієї молекули дволанцюгової ДНК утворюється дві молекули, ідентичні одна одній і вихідній молекулі. Це слугує передумовою збереження видоспецифічної спадкової інформації в ряді поколінь клітин і організмів, передумовою значної постійності видів.

Редуплікація бактеріальних геномів та інших кільцевих молекул ДНК починається у певній, генетично фіксованій "точці старту". У хромосомах еукаріот є по декілька таких початкових точок. Редуплікація ДНК відбувається частинами. Репліковані часткові послідовності з 1000‑2000 нуклеотидів називають фрагментом Оказакі. На обох старих ланцюгах новий поліпептидний ланцюг синтезується у напрямі 5' → 3'. Починаючись точкою старту, реплікація здійснюється послідовно на окремих ділянках; при цьому в еукаріот і багатьох бактерій вона йде вздовж подвійної спіралі ДНК не тільки в одному напрямі, а і в протилежному. ДНК-полімерази можуть приєднувати нуклеотиди не тільки вільного З'-ОН-кінця нуклеотиду, вже зв'язаного зі старим ланцюгом ДНК. Тільки РНК-полімерази спроможні зв'язати перший нуклеотид з ДНК і почати новий полінуклеотидний ланцюг. Тому для того, щоб міг синтезуватися фрагмент Оказакі, спочатку повинен бути прибудований короткий відрізок РНК (як при транскрипції). Ця послідовність РНК із 1 – 10, рідше – близько 50 нуклеотидів, називається затравкою (або праймером) і синтезується РНК-полімеразою, або примазою. Від З'-кінця затравки за допомогою ДНК-полімерази III починається синтез ДНК-фрагмента Оказакі, який продовжується до кінця даного фрагменту. Наступний фрагмент Оказакі знову починається з РНК-затравки. ДНК-полімераза І видаляє затравки, а пропуски заповнюються шляхом синтезу ланцюга ДНК, приєднаного до попереднього фрагмента Оказакі. Потім фермент лігаза зв'язує між собою синтезовані відрізки ДНК. Для реплікації подвійна спіраль ДНК розкручується ферментами. Реплікація на старому ланцюгу, що йде від точки старту в напрямі 3'-> 5', може йти безперервно вздовж подвійної спіралі, яка розкривається подібно до застібки-блискавки. Реплікація на другому ланцюгу відбувається окремими фрагментами, оскільки на цьому ланцюгу новий ланцюг повинен синтезуватись у протилежному напрямі (відповідаючи також напрямку 3' → 5' старого ланцюга). Спарювання основ за участю ДНК-полімерази відбувається майже безпомилково. Перед зв'язуванням нового нуклеотида додатково перевіряється, чи правильним було попереднє спарювання. Якщо воно було помилковим, непотрібний нуклеотид видаляється завдяки 3' → 5' ендонуклеазній активності полімерази. При реплікації бактеріальних ДНК та інших кільцевих ДНК-структур у кінцевому підсумку одержуються дві ідентичні кільцеві молекули ДНК. В еукаріот різні реплікаційні ділянки хромосоми в кінці кінців об'єднуються так, що після завершення фази 8 у кожній хромосомі знаходяться дві молекули дволанцюгової ДНК, які стають двома ідентичними хроматидами. Структура, здатна до реплікації (наприклад, хромосома, плазміда, вірусний геном), називається репліконом. Тільки структури з властивостями реплікона можуть зберігатися в ряді поколінь, тобто спадкуватися. ДНК здатна до реплікації завдяки наявності специфічної ділянки, яка може слугувати стартовим пунктом дляРеплікації. В еукаріот реплікація ДНК відбувається в інтерфазі. У бактерій реплікація ДНК починається в умовах, сприятливих для росту. Може відбутися декілька циклів реплікації один за одним. При цьому ті ділянки геному, з яких починається реплікація, можуть виявитися повтореними в клітині багаторазово. У фагів Т4 приблизно за 10 секунд при 14 °С зв'язується 1000 нуклеотидів.

Генетична інформація закодована в ДНК. Інформація, яка знаходиться в клітинному ядрі, являє собою Генотип. ДНК, що міститься в одному наборі хромосом, називається Геномом, а позаядерна ДНК (у мітохондріях, пластидах і основній речовині цитоплазми) – Плазмоном. У бактерій ДНК у еквіваленті ядра являє собою геном, а позаядерна ДНК представлена у формі плазмід. Структури, які складаються із ДНК, що трапляються в основній речовині цитоплазми в еукаріот, так само як і в бактерій, називають Плазмідами.

Генетична інформація в геномі бактерій і багатьох вірусів знаходиться в одному-єдиному безперервному полінуклеотидному ланцюгу. В еукаріот генетичний матеріал розподілений по хромосомах і в кожній хромосомі утворює один довгий нуклеотидний ланцюг. Полінуклеотидні нитки ДНК, які містяться в хромосомах еукаріот, в геномі бактерій і вірусів або плазмідах (у деяких вірусів – РНК), поділяються на функціональні відрізки, які називаються Генами.

Розрізняють:

1. Структурні гени, в яких закодована інформація для синтезу ферментних і структурних білків.

2. Гени з інформацією для синтезу т-РНК (транспортні РНК).

3. Гени з інформацією для синтезу рибосомальної РНК (р-РНК).

4. Специфічні регуляторні ділянки, такі як промотори та оператори. Промотор – передуюча гену послідовність приблизно із 80 нуклеотидів, яку пізнає і з якою зв'язується фермент РНК-полімераза; ОператорЦе послідовність приблизно із 30 нуклеотидів, яку "впізнає" репресор. Ця послідовність має дзеркальну симетрію. Репресор являє собою алостеричний білок, який може приймати дві специфічні ділянки: одна для приєднання до оператора та одна для зв'язування ефектора. Приєднуючись до оператора, репресор блокує транскрипцію.

5. Розділяючі ділянки між генами (спейсери). Спейсери – неінформативні відрізки ДНК різної довжини (інколи більше 20000 пар основ), які, напевно, мають значення для регулювання транскрипції сусіднього гена.

6. Ділянки з невідомою функцією (конститутивний гетерохроматин завжди гетерохроматичний). Він складається із послідовностей основ, які багаторазово повторюються, не інформативний (не містить генів) і тому завжди не активний стосовно транскрипції. Його можна бачити і під час ділення ядер. Найчастіше він зустрічається біля центромери, на кінцях хромосом (включаючи сателіти), а також поблизу організатора ядерця).

У 1977 р. з'явилась можливість визначати послідовності нуклеотидів у ДНК. З тих пір визначені послідовності для деяких повних геномів і для багатьох частин геномів та зроблені висновки про їхні функції.

Під час трансляції нуклеотидна послідовність і-РНК переводиться в амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга. Генетичний код слугує ключем для переведення послідовності нуклеотидів у послідовність амінокислот. Як при перекладі з однієї мови на іншу необхідно знати слова, так і тут потрібно знати, як кожна амінокислота закодована в нуклеотидах. За період з 1961 по 1964 р. р. завдяки працям дослідницьких груп Ніренберга та Очоа вдалось вияснити генетичний код. Результати цих праць виявились одним з найзначніших кроків у розумінні життєвих процесів. Ці результати можна коротко резюмувати таким чином:

1. Генетичний код являє собою триплетний код. Триплет і-РНК отримав назву кодона.

2. Генетичний код є виродженим кодом, тобто одній амінокислоті, як правило, відповідає більше ніж один кодон. У кодонах для однієї амінокислоти перші два нуклеотиди найчастіше однакові, а третій – варіює.

3. Нуклеотидна послідовність зраховується в одному напрямі підряд, триплет за триплетом. Кодони не перекриваються.

4. АУГ являє собою стартовий кодон.

5. УАГ, УАА та УГА – кодони-термінатори.

6. Генетичний код – універсальний, він єдиний для всіх організмів і вірусів.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить