Лісова генетика. Навчальний посібник. Г.Г. Баранецький, Р.М. Гречаник. 2003 р.
  • Регистрация
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 0.00 (0 Голоса)

Розділ 13. генетична інженерія

Генетична інженерія – це прикладна ланка молекулярної біології. Мета її – створення нових генетичних структур. Вона включає конструювання біологічних систем на різних рівнях організації живого: генному, геномному, клітинному, організменному, популяційному.

Генна молекулярна інженерія – створення активних рекомбінантних молекул з послідовним введенням їх у клітину. У результаті одержують клони клітин з новими спадковими властивостями.

Геномна інженерія створює організми з новим набором хромосом (капустяно-редисковий гібрид, бестер, мул).

Клітинна інженерія – одержання гібридів соматичних клітин (культура гаплоїдних клітин, протопластів, тканин пильників).

Біологічне конструювання на рівні окремого організму – вирощування із окремих клітин цілого організму, пересадка органів, тканин, а у перспективі – штучне створення цілих організмів.

Біологічна інженерія на рівні популяції ставить перед собою задачу змінити склад генофонду популяції тварин, рослин, мікроорганізмів у вигідних для людини границях.

Про прикладний аспект генетичної інженерії заговорили у 1971 році, коли американські вчені К. Мерилл, М. Гайор і Дж. Петрічеллі при допомозі фага перенесли із хромосоми кишечної палички у клітину людини ген, який детермінує синтез фермента галактозо-б-фосфатуридилтрансферази.

Одержання рекомбінантних молекул. Оскільки штучно створені гени не включаються в хромосому клітини господаря, то для цієї мети використовують вектор, який створюється на основі плазміди, фага або віруса. Разом з вектором у клітину проникає зв'язана з ним чужа ДНК.

Перенесення генетичної інформації. Відомо кілька шляхів переносу генетичної інформації із клітини у клітину.

1. Трансформація – перенесення генетичної інформації за допомогою ДНК. Відкриття трансформації у бактерій і особливо ідентифікація ДНК як трансформуючого агента стимулювали спроби трансформації у тварин і еукаріотичних мікроорганізмів. При цьому спроби провести трансформацію з допомогою препаратів тотальної геномної ДНК привели до протилежних результатів. Тільки у кінці 70-х років були одержані результати із застосуванням вільної трансформаційної ДНК.

2. Трансдукція – перенесення генетичної інформації за допомогою вірусів.

3. Гібридизація соматичних клітин у вищих організмів і коньюгація у мікроорганізмів і простіших.

4. Трансгресія – включення в геном клітини і реалізація генів віруса, який проник у клітину. Це можливо тільки у вищих організмів.

Експериментально доказано, що ДНК без допомоги фага і плазмід може проникнути всередину клітини і передати деякі спадкові ознаки. Це явище назване трансформацією, було описане у 1944 р. О. Т. Овері. Трансформація можлива не тільки у бактерій, але у вищих організмів, в тому числі і у деревних рослин, перенесення генів за допомогою ДНК із однієї клітини (еукаріот) у другу, не порушуючи їх функціональної активності. Трансдукція відрізняється від трасформації тільки тим, що ДНК переноситься з допомогою віруса (фага). Трансдукція може бути здійснена не тільки між клітинами одного виду, але і між клітинами різних видів вищих організмів. Віруси у складі свого генома здатні переносити генетичну інформацію.

В основі цього підходу – використання векторних молекул або векторів, для яких використовували плазміди спочатку бактеріальних, а потім еукаріотичних клітин.

Вектори – це молекули ДНК, здатні переносити включені в них гени у клітину, де ці молекули реплікуються автономно або після інтеграції в геном. Вирішальну роль в цих експериментах відіграли методи одержання індивідуальних генів, нагромадження їх препаративних кількостей шляхом клонування, тобто практично необмеженного розмноження в бактеріальних клітинах. Під час розробки цих процедур була створена потужна техніка генної інженерії, яка включила: виділення індивідуальних фрагментів ДНК будь-якого походження, їх стабільне відтворення у складі векторів, ідентифікація функцій клонованих таким чином генів, їх заміна і введення у клітини вихідного або іншого організму. Ця техніка, яка дістала також назву техніки рекомбінантної ДНК, у сполученні з методами розшифрування первинної структури генів, тобто їх нуклеотидної послідовності, зробила можливим експериментуваня безпосередньо на генетичному матеріалі, маніпулювання в наукових і практичних цілях.

Головну роль на першому етапі виділення гена відводять ендонуклеазам рестрикції або рестриктазам. Ці ферменти розрізають ДНК поблизу або всередині певних послідовностей нуклеотидів, які одинакові на двох комплементарних ланцюгах. Два розриви в одинакових позиціях комплементарних ланцюгів на кінцях фрагментів утворюють так звані липкі кінці, які можуть знову замикатися завдяки комплементарності основ. Послідовності, які пізнаються рестриктазами, статистично розкидані по геному. Чим коротша послідовність, тим частіше вона зустрічається і відповідно тим коротші фрагменти ДНК, які утворюються при реєстрації. Рестрикти можна розділити за їх молекулярною масою і зарядом при допомозі електрофорезу. У даний час із різних мікроорганізмів виділено багато рестриктаз з неоднаковою специфічністю по відношенню до нуклеотидних послідовностей ДНК. Разом з цим найбільш поширеним методом одержання генів існує також спосіб їх хімічного синтезу. Методологія синтезу ДНК з заданою послідовністю нуклеотидів була розроблена Г. Кораною у 60-х роках, ще задовго до наступлення ери генної інженерії. Після того, як була розшифрована первинна структура першої індивідуальної нуклеїнової кислоти – аланінової т-РНК дріжджа Г. Корана з співробітниками синтезував хімічним шляхом кодуючу частину гена для цієї РНК. Далі, у 1976 році в тій же лабораторії був синтезований ген тирозинової т-РНК Е. Соli, який працював після введення у клітини кишечної палички. Методологія, розроблена Г. Корана, широко застосовується для синтезу цілих штучних генів, наприклад, генів гормону інсуліну, які вводяться пізніше в бактеріальні або дріжджові клітини – продуценти.

Існує два методи синтезу гена: перший – хімічний, другий – матричний. При хімічному методі по амінокислотній послідовності можна відтворити послідовність нуклеотидів ДНК з допомогою генетичного коду, зчитуючи його по принципу комплементарності, послідовність амінокислот переводиться у послідовність нуклеотидів. При матричному синтезі необхідно виділити із клітини і-РНК даного гена, а далі з допомогою оберненеї ревертації синтезувати його у комплементарну послідовність нуклеотидів ДНК

У даний час існують автомати для синтезу ДНК заданої послідовності. Ці методи застосовують для синтезу так званих ДНК-зондів, тобто невеликих ділянок генів (20‑30 нуклеотидів). Це можливо, якщо відома хоч частина первинної структури потрібного білка. Тоді користуючись таблицею генетичного коду можна розшифрувати структуру відповідної ділянки гена. Такі зонди використовують для пошуків потрібної комплементарної їм і-РНК. Виділену при допомозі зонду і-РНК використовують для синтезу так званої к-ДНК (комплементарної ДНК), з допомогою фермента оберненої транскриптази.

Хімічний і ензиматичний синтез генів має певні переваги перед їх пошуками серед рестрикційних фрагментів. Але вони мають і недоліки, оскільки синтетичні гени часто позбавлені багатьох регуляторних елементів, необхідних для їх повноцінної експресії.

Важливим моментом в генній інженерії є клонування і наявність векторів.

Для виділення потрібного фрагмента ДНК у препаративних кількостях його необхідно вбудувати у плазміду – вектор, розкритою тією ж рестриктазою, яку використовували для одержання рестриктів геномної ДНК.

Не завжди вдається одержати фрагменти ДНК з липкими кінцями. Ці кінці можуть бути "пришиті" до фрагментів ДНК штучно, якщо ДНК одержана при допомозі рестриктази, яка утворює "тупі" кінці або внаслідок гідродинамічної фрагментації. Один ланцюг таких молекул з тупими кінцями нарощують при допомозі нуклеотид - трансферази.

Говорячи про клонування фрагменту ДНК, ми припускали, що нам доступний шуканий ген або відома молекулярна маса фрагмента, якого можна виділити із електрофореграми рестрактів ДНК. У дійсності для одержання потрібного гена найчастіше необхідні пошуки і часом досить складні. Для цього геномну ДНК, розрізану вибраною рестриктазою, змішують з ДНК вектора, виявленою тією ж рестриктазою за унікальним сайтом. У результаті взаємодії липких кінців і наступного лавірування одержують суміш рекомбінантних ДНК. Після цього одержані плазміди із вставками різних ділянок ДНК необхідно розклонувати.

Розміри банку генів, необхідні для повного клонування того або іншого геному, можна визначити, знаючи молекулярну масу генома (М), середній розмір клонованого фрагмента (м) і задаючи певну ймовірність (Р) того, що клонований ввесь геном. Тоді об'єм банку, тобто число клонів (N) дорівнює:

image001

Генна інженерія і вектори для клонування генів рослин існують у природних умовах.

Пухлинне захворювання рослин відоме, як корончастий гал, описаний ще Аристотелем. На початку нашого століття Е. Сміт і К. Таундсен (1907) показали, що викликає це захворювання ґрунтова бактерія. Виділена у вигляді чистої культури Ayrobactea tumefaciens здатна проводити до утворення пухлин у деяких представників голонасінних і більшості дводомних покритонасіневих рослин. Клітини рослинних пухлин інтенсивно ростуть на штучних середовищах і при цьому не вимагають додаткових фітогормонів на відміну від клітин нормальних тканин.

У 70-х роках вияснилось, що причиною пухлиноутворення є так звані Ті-плазміди, виявлені у клітинах деяких штамів А. tumefaciens. Ті-плазміди це кільцеві молекули ДНК розміром 50‑80 мкм. Ці плазміди проникають із бактерій у клітини рослин, і частина ДНК Ті-плазміди, так звана Т-ДНК, ковалентно вбудовується в хромосоми інфікованої рослини і стимулює гіперпродукцію фітогормонів: цитокінінів і індилілоцтової кислоти (ауксину), а також синтез багатьох амінокислот, об'єднаних загальним терміном опіни. Пухлина виникає внаслідок порушення балансу фітогормонів, від якого залежить нормальний морфогенез рослини. Опіни, виділені клітинами пухлини, бактерія використовує як джерело вуглецю та азоту, але тільки в тому випадку, коли А. tumefaciens вміщує Ті-плазміду, яка заразила клітини рослини. Ті-плазміди відносяться до класу коньюгативних плазмід, тобто може передаватися у клітини А. tumefaciens, які позбавлені її.

Першими чужорідними генами, введеними на початку 80-х років у вищі рослини були гени стійкості до антибіотиків із Е. Соli. У клітини соняшника з допомогою Ті-плазміди був переданий ген фазеоліну бобів. Фазеолін – це глікопротеїн, який складає до 50 % запасного білка бобів. Майбутня рослина, одержана у вигляді калусної маси, дістала назву санбін. Цей же ген фазеоліну введений в тютюн і одержані рослини-регенеранти, які синтезують менше 1 % фазеоліну від загального білка рослини. Такі рослини світяться в темноті завдяки експресії в них гена люциферази світлячка. Це перші кроки генної інженерії рослин.

Надзвичайно важливим в генетичній інженерії є рестрикційне картування ДНК.

Встановлення точок дії різних рестриктаз дозволяє проводити фізичне картування ділянок молекули ДНК і невеликих геномів (плазмід вірусів). Розподіл сайтів рестрикції являє собою своєрідний паспорт кожного фрагменту ДНК і може бути використаний для його ідентифікації. Принцип рестрикційного картування зводиться до одержання фрагментів, що перекриваються за розмірами, які розділяють при допомозі електрофорезу в агаризованому або поліакриламідному гелі. Молекулярну масу фрагментів звичайно визначають, використовуючи, як "свідка" ДНК відомого розміру. На електрофореграмі реєстрикти-фрагменти ДНК відрізняють, зафарбовуючи їх бромистим етиленом і проглядаючи гель в ультрафіолетовому світлі. Застосовують також радіоактивне мічення кінців фрагментів з допомогою полінуклеотидкінази фага Т4.

Ще недавно методи генної інженерії були предметом чисто теоретичних пошуків. Починаючи з 1979 року появляються повідомлення про цінні біологічно активні речовини, вироблені бактеріями, яким пересаджені відповідні гени вищих організмів. Такі речовини називають біосинтетичними.

1980 році в Лондоні вперше в історії генної інженерії одержаний біосинтетичний інсулін був випробуваний на групі добровольців. Вияснилось, що рівень цукру у крові знижується досить ефективно.

Досліди в галузі клітинної інженерії рослин досягли тої стадії, коли можна говорити про використання цього нового способу гібридизації при практичній селекції рослин. Хоч принципові можливості "поведінки" генів у даному випадку ще не до кінця вивчені, доказано, що соматична гібридизація значно розширює рамки схрещуванності.

Соматична гібридизація вже доказала свою високу ефективність. Так одержані міжвидові гібриди тютюну, картоплі, томатів, турнапсу, капусти з їх дикими родичами. Всі ці схрещування велись, так би мовити, на замовлення селекціонерів і дають цінний вихідний матеріал для селекції нових сортів.

Генетична інженерія на клітинному рівні виникла тоді, коли появились методи так званої соматичної гібридизації, тобто злиття двох різних клітин у культурі тканин. Це проходить тоді, коли пошкоджені у клітин клітинні мембрани. Такі пошкодження викликає вірус Сендая, який перед пошкодженням інактивують ультрафіолетовим промінням. Такіж пошкодження отримують шляхом обробки клітин певними хімічними речовинами. Можуть зливатися різні види клітин одного організму і клітини різних, інколи дуже віддалених видів. Після злиття клітини утворюють одну велику клітину з двома різними ядрами. Такі клітини називають гетерокаріонами. Досліди з гетерокаріонами показали, що в цьому випадку, коли починається синтез ДНК в одному ядрі, то він стимулюється і у другому. Обидва ядра, як правило, приступають до поділу одночасно та їх хромосоми змішуються. При цьому гетерокаріон ділиться на дві клітини. Кожна клітина має по одному ядрі з хромосомами обох видів. Такі клітини називаються синкаріонами. Отримані синкаріони миші і щура, собаки і кота, людини і миші. Такі гібридні клітини використовуються у дослідах по локалазації генів і взаємодії генів.

Використовуючи речовини, які впливають на клітинні мембрани і цитоскелет, отримують більш складні комбінації. Ізолюють ядро і безядерну клітину, переміщують ядро із однієї клітину в іншу. Такі операції зараз проводять не на одинакових клітинах за допомогою мікрохірургії, а на мільйонах клітин. Клітинна інженерія тваринних клітин значною мірою ограничена, так як із синкаріонів надзвичайно важко виростити дорослий організм. Значно легше таким шляхом отримати міжвидові гібриди рослин.

Культивування клітин рослин почалось дещо пізніше від тваринних клітин. Це стало можливим, коли навчились з допомогою ферментів звільняти рослинні клітини від міцної целюлозної оболонки. Такі клітини без клітинної оболонки називають протопластами. Протопласти можна культивувати так як і тваринні клітини, отримати соматичні гібриди, вводити в них чужу ДНК. На відміну від тваринних клітин протопласти багатьох рослин, поміщені в необхідних умовах, утворюють комок клітин-калус. У результаті диференціації із калуса виростає стебло, листя, коріння. Тобто формуються повноцінні рослини, які можна пересаджувати у землю. Таким шляхом отримують гібриди між рослинами, які в нормальних умовах не схрещуються. Методи клітинної інженерії рослин, настільки прискорили селекцію, що досягнуті результати у середині 80-х років часто називають зеленою революцією.

Для вивчення закономірностей функціонування диференційованих клітин пересаджують ядра із соматичних клітин в енуклейовані яйцеклітини тварин. Утворюють також гібриди між раковими і нормальними клітинами. Такий підхід широко використовують при одержанні так званих моноклональних антитіл на основі вирощування гібридів. Як відомо, специфічні антитіла у відповідь на введення в організм тваринного антигену (найчастіше чужого білка) виробляються певними клонами клітин імунної системи. Ці клітини, виділені із селезінки імунізованої тварини, зливаються з клітинами меланоми- одного із типів злоякісної пухлини. У результаті утворюються гібридоми, які об'єднують якості обох батьківських форм: від клітини імунної системи – здатність виробляти певні антитіла, а від клітини меланоми – здатність необмежено довго ділитися у культурі.

Вдається не тільки злиття соматичних клітин, але і реконструкція цілих клітин із їх окремих компартментів. Так, можна енуклеювати клітини савців, діючи на них цитохалазином. Цитохалазин викликає виштовхування ядер з клітин. У результаті такої обробки утворюються безядерні клітини – цитопласти і вільні ядра, оточені тонким шаром цитоплазми – каріопласти. Цитопласти можна зливати з нормальними клітинами та одержувати ядерно-цитоплазматичні гібриди або цибриди.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить